高效液相亲水作用色谱－串联质谱法同时测定人尿液中烟碱及其9种代谢物

丁 丽，赵继俊，陈志浩，蒋锦锋，叶长文，陈 宸，贺 琛，赵 阁

（中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州 450001）

烟碱（Nicotine，NIC）是烟草中的主要生物碱，约占烟草生物碱总量的90%以上。卷烟抽吸时，约有40%的烟碱直接转移至卷烟的主流烟气和侧流烟气中［1］。人类吸入烟气后，烟碱主要代谢为可替宁（COT）以及少量的烟碱氮氧化物（NNO）、降烟碱（NNIC）和烟碱糖苷（NIC－G）。COT进一步代谢为反-3′-羟基可替宁（OHCOT）、可替宁氮氧化物（CNO）、可替宁糖苷（COT－G）和降可替宁（NCOT）。OHCOT可进一步代谢为反-3′-羟基可替宁糖苷（OHCOT－G）。此外，人尿液中还有其他烟碱代谢物，但仅占烟碱代谢物总量的10%以下［2］。因此，同时测定人尿液中烟碱及其代谢物能有效评估烟碱的暴露情况［3］。

光度法［4－6］、免疫法［7－8］和色谱法［9－16］已被应用于人体体液中烟碱及其代谢物的测定。其中，气相色谱－质谱法和液相色谱－质谱法由于其优越的灵敏度和选择性而被广泛应用于人体体液中烟碱及其代谢物的测定。NIC和COT主要采用气相色谱－质谱法［9－12］直接检测，OHCOT需经衍生化后由气相色谱－质谱法检测，糖苷类（COT－G和OHCOT－G）主要通过气相色谱－质谱间接测定由β-葡萄糖苷酶水解后的苷元得到其含量［9，11］。液相色谱－质谱法更便捷，可直接用于烟碱代谢物，包括糖苷类代谢物的测定［13－18］。本课题组曾报道了一种液相色谱－质谱法检测尿液中烟碱及其9种代谢物的方法［13］，尿液用水稀释后直接进样，然而由于COT－G在反相柱中保留较弱，出峰较早（保留时间为1.96 min），基质效应影响大，导致尿液样品中该峰的峰形差。因此，本文尝试用亲水作用色谱分离烟碱及其代谢物以改善COT－G的分离度，提高质谱检测的灵敏度。亲水作用色谱－串联质谱已应用于吸食无烟气烟草制品的冰球运动员尿液中NIC、COT和OHCOT的同时检测［19］，显示出较好的分离度、峰形以及较高的灵敏度，但该方法前处理较繁琐。

本研究建立了一种同时检测烟碱及上述9种代谢物的溶剂直接稀释结合高效液相亲水作用色谱－串联质谱方法，目前尚无相关报道。该方法的前处理简单，且亲水作用色谱改善了COT－G的分离效果，高有机相比例的流动相提高了质谱检测灵敏度。该方法适用于大批量样品的检测，为评价人类卷烟烟气暴露量提供了一种快速、灵敏的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；API4000液相色谱－质谱联用仪（美国应用生物系统公司）；Atlantis HILIC Silica色谱柱（3.0 mm×100mm，3.0 µm，美国安捷伦公司）；Milli－Q50超纯水仪（美国Millipore公司）；CP2245分析天平（感量0.0001 g，德国Sartorius公司）；0.22 µm有机滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

超纯水（电导率≥18.2 MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色谱纯，迪马公司）；甲酸铵（色谱纯，安谱公司）；NIC、NIC－G、COT、COT－G、OHCOT、OHCOT－G、NNIC、NCOT、CNO、NNO、NNIC－D4、COTD3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4（色谱纯，加拿大TRC试剂公司）。

尿液样品来自招募的自愿者，自愿者按照自身的消费习惯抽吸卷烟，取24h尿样，弃去晨尿，尿液收集于洁净容器中于－18℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制分别准确称取适量NNIC、COT、NCOT、OHCOT、CNO、COT－G、NIC－G、OHCOT－G、NNO和NIC，用甲醇配成质量浓度分别为20、300、20、400、50、200、200、200、100、300µg/mL的标准储备液，于－18℃避光保存。

分别准确称取适量NNIC－D4、COT－D3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4，用甲醇配制成质量浓度分别为1、2、0.2 、2、0.2 、2、2、2、1、2mg/mL的内标储备液，于－18℃避光保存。

准确移取适量内标储备液，用乙腈/甲醇混合溶剂（体积比3∶1）配制成NNIC－D4、COT－D3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4的质量浓度分别为1、2、0.2 、2、0.2 、2、2、2、1、2µg/mL的混合内标工作溶液，于－18℃避光保存。

准确移取适量标准储备液于10mL容量瓶中，加入200µL混合内标工作溶液，用乙腈/甲醇混合溶剂（3∶1）配制成NNIC和NCOT的质量浓度为0.2 ～20ng/mL，CNO为0.5 ～50ng/mL，NNO为1～100ng/mL，COT－G、NIC－G和OHCOT－G为2～200ng/mL，NIC和COT为3～300ng/mL，OHCOT为4～400ng/mL的系列混合标准工作溶液，于－18℃避光保存。

1.2.2 样品前处理尿液于室温下解冻后取500µL，加入200µL混合内标工作溶液，用乙腈/甲醇混合溶剂（3∶1）定容至10mL，充分混合后，过0.22 µm有机相滤膜，待分析。

1.2.3 分析条件 色谱柱：Atlantis HILIC Silica柱（3.0 mm×100mm，3.0 µm）；柱温：25℃；进样量：10µL；流速：0.30 mL/min。流动相：A为10mmol/L甲酸铵水溶液（用甲酸调至pH3.0 ），B为乙腈；进样前，色谱柱平衡16min。梯度洗脱程序：0～11min，95%～30%B；11～13min，30%～95%B；13～16min，保持95%B。

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；雾化气（N2）：3.45 ×105Pa；辅助加热气（N2）：3.45 ×105Pa；气帘气（N2）：6.89 ×104Pa；电喷雾电压：5000V；干燥温度：500℃；扫描时间：40ms；检测模式：多反应监测模式。烟碱及其代谢物的定量离子对（Q1/Q3）、去簇电压（DP）、碰撞能（CE）及保留时间（RT）见表1。

表1 目标分析物及其同位素内标的质谱参数与保留时间Table1 MS parameters and retention times of the analytes and internal standards

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

尿液直接稀释进样是比较简单的前处理方法。采用C18柱分离烟碱及其代谢物时，可采用水作为稀释溶剂［13］。而采用亲水作用色谱柱分离烟碱及其代谢物，水并不是理想的样品稀释剂，因为水的溶剂强度大于乙腈，若进样溶剂的溶剂强度大于初始流动相，会造成色谱峰形扩展。在亲水作用色谱中，乙腈是很好的样品稀释剂，能保证良好的色谱峰形，但部分烟碱及其代谢物的重复性较差，其中NCOT、NIC－G的相对标准偏差（RSD）大于10%，这可能是由于分析物在乙腈中的溶解度不高所致［20］。考虑到分析物能溶于甲醇，且在HILIC色谱系统中甲醇的溶剂强度小于水，因此，本实验以乙腈/甲醇混合溶剂（体积比3∶1）为稀释剂，考察了不同的稀释比例（5、10、20、30倍）对目标物色谱峰形的影响。结果表明：不同的稀释比例导致进样溶剂的组分和分析物浓度不同，因此对色谱峰形和灵敏度均有影响。尤其是出峰较早的COT、NCOT和OHCOT的色谱峰形受样品溶剂强度的影响较大，以COT为例（如图1），当稀释倍数为5和10倍时，峰扩展较严重，当稀释倍数为20和30倍时，色谱峰形较好。综合考虑分析物的色谱峰形和检测灵敏度，最终选择稀释比例为20倍。

图1 COT在不同稀释倍数下的色谱峰Fig.1 Chromatographic peaks of COT at different dilution times

2.2 检测条件的优化

在亲水作用色谱中，为降低分析物和固定相硅醇基之间的静电相互作用，保持流动相的pH值和固定相硅醇基离子化状态的稳定，通常建议流动相具有一定的缓冲能力。文献显示，pH3.0 的甲酸铵水溶液由于其自身的缓冲能力、对高比例乙腈的互溶性和有利于提高质谱检测灵敏度的特点，是亲水作用色谱首选的流动相［20］。因此，本实验采用pH3.0 的甲酸铵水溶液为水相流动相。

实验对质谱条件进行了优化，由于各分析物偏碱性，所以采用正离子模式进行检测。在正离子模式下，以流动注射的方式对各分析物的标准溶液（lµg/mL）进行全扫描，确定了各分析物的母离子（［M+H］+），然后分别以［M+H］+选择对应的子离子（碎片），选取信号较强、无互相干扰的碎片作为定量离子。最后以多反应监测（MRM）模式优化雾化气、辅助加热气、气帘气、电喷雾电压和干燥温度等质谱分析参数，优化结果见表1。在“1.2.3”分析条件下，尿液中烟碱及其9种代谢物与相应同位素内标的MRM色谱图见图2。

图2 烟碱及其代谢物与同位素内标的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of nicotine，its metabolites and deuterated internal standards

2.3 方法学评价

2.3.1 基质效应 基质效应是指样品中的背景杂质对目标物质竞争电离所致的质谱信号增强或抑制现象，会影响样品定量的准确性。本实验采用标准曲线测定法对基质效应进行考察，通过空白基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值进行评价，当斜率比为80%～120%时，表明基质作用较小［21］。将目标物的空白基质和纯溶剂（体积比3∶1的乙腈/甲醇混合溶剂）按照“1.2.1”配成相同质量浓度的系列混合标准工作溶液，采用本方法进行分析（见表2）。结果表明：基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率比值为94%～110%，说明本方法的基质效应小，该前处理方法结合同位素内标能有效减少基质效应。

2.3.2 线性关系、检出限与定量下限 采用同位素内标法进行定量，取“1.2.1 ”配制的系列混合标准工作溶液，以目标物的质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，目标物与相应的内标峰面积比（y）为纵坐标进行线性回归。结果显示，烟碱及其9种代谢物在各自的质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）均大于0.997 。分别按信噪比（S/N）为3和10的质量浓度确定检出限（LOD）与定量下限（LOQ），得到10种目标物的LOD和LOQ分别为0.03 ～0.24 ng/mL和0.10 ～0.80 ng/mL（见表2）。

表2 10种目标物的基质和溶剂标准曲线的线性关系、斜率比值、检出限和定量下限Table2 Linear relations，slope ratios of ten analytes in the solvent and urine matrix，LODs and LOQs

2.3.3 回收率与相对标准偏差用空白基质加入低、中和高水平的烟碱及其代谢物标准溶液，分别考察方法在不同加标水平下的回收率。其中，中等加标水平相当于吸烟者尿液中的烟碱及其代谢物浓度。对中等水平加标样品进行5次日内和日间平行测定，以日内和日间RSD考察方法的精密度（见表3）。结果表明，低、中、高3个加标水平下的回收率为81.9 %～110%，日内和日间RSD为0.50 %～6.7 %，符合生物样品的分析要求。

表3 烟碱及其代谢物的日内、日间相对标准偏差及回收率Table3 Intra-day and inter-day RSDs and recoveries of nicotine and its metabolites

2.4 实际样品的检测

采用本方法对采集的172个卷烟消费者的尿液样品进行检测，结果显示，由于所吸卷烟焦油含量不同且存在个体代谢差异，所采尿液中烟碱及其9种代谢物的质量浓度存在差异，平均质量浓度及其范围如下：NIC、COT、OHCOT、NIC－G、COT－G、OHCOT－G、NNIC、NCOT、NNO、CNO的平均质量浓度为814.2 、1182.2 、2384.7 、603.8 、1733.3 、657.4 、33.6 、19.1 、259.7 、159.9 ng/mL，范围分别为0～4260ng/mL、9.1 ～3580ng/mL、0～8460ng/mL、8.2 ～2180ng/mL、10.3 ～6360ng/mL、9.0 ～2373.5 ng/mL、0～137.8 ng/mL、0.4 ～60ng/mL、0～1118ng/mL、0～638ng/mL。以每种代谢物占烟碱及其代谢物总量的百分比计算，NIC为8.7 %、COT为17.3 %、OHCOT为30.4 %、NIC－G为7.9 %、COT－G为21.1 %、OHCOT－G为8.6 %、NNIC为0.4 %、NCOT为0.3 %、NNO为3.4 %，CNO为1.9 %，与文献［14，22］报道数据的一致性较好。

3 结 论

本文建立了同时检测人尿液中烟碱及其9种代谢物的高效液相亲水作用色谱－串联质谱法。采用体积比为3∶1的乙腈/甲醇混合溶剂将尿液样品稀释20倍，过0.22 µm滤膜后直接进样分析。亲水作用色谱不仅改善了分析物的峰形，且高有机相比例流动相的使用提高了质谱检测的灵敏度。该方法前处理简单、灵敏度高、稳定性好，适合大批量尿液中烟碱及其9种代谢物的检测。