枪头式羧基化多壁碳纳米管固相萃取/高效液相色谱测定饮用水中双酚类化合物

朱培杰，涂雪元，周家欢，陈奕全，刘艳清，汪洪武

（肇庆学院 食品与制药工程学院，广东 肇庆 526061）

双酚类化合物（Bisphenols，BPs）是一类重要的有机化工原料，被广泛用于塑料瓶、食品接触涂层、化妆品、药物等各类工业和消费产品中［1－2］。这些产品与人类的日常生活密切相关，近年来世界各地的饮用水中均检出了该类物质［3－4］。大量研究表明，双酚类物质是潜在的内分泌干扰物，与多种人类疾病显著相关，如生殖毒性、甲状腺功能障碍、器官损伤、肥胖促进作用等［5－7］。因此，建立快速、准确、灵敏、高效的分析方法对于饮用水中双酚类物质的监测尤为重要。

双酚类物质在饮用水中的残留浓度低，且水体有一定的干扰物，因此需对样品进行前处理。目前，常用的样品前处理技术主要包括液液萃取［8］、分散液液微萃取［9］、免疫亲和柱净化［10］、分子印迹技术［11］和固相萃取（SPE）［12］等。其中，SPE技术可同时完成样品的富集和净化，操作简便，已被广泛用于水样中双酚类化合物的前处理［13－14］。固相萃取吸附剂是影响SPE柱富集和净化效果的关键因素，常用的吸附剂包括活性炭、键合硅胶、分子印迹吸附剂和纳米材料等［15］。通常，SPE柱中需加入20～30mg的固相萃取吸附剂，才能对样品中的分析物进行充分吸附。由于固相萃取吸附剂价格昂贵，在一定程度上增加了实验成本。

多壁碳纳米管（MWCNTs）作为一种磁性材料，具有离域大π电子系，可通过非共价作用富集芳香类化合物，不受氢键和pH值干扰，是一种理想的固相萃取吸附剂。此外，MWCNTs还具有超高的比表面积，几毫克的用量即可满足实际样品中待测物的富集需求，可降低实验成本。Guo等［16］以3mg MWCNTs为固相萃取吸附剂，结合气相色谱－质谱（GC－MS）检测技术，实现了对环境水样中16种多环芳烃的定量检测。Springer等［17］采用6mg MWCNTs为固相萃取吸附剂，结合毛细管电泳（CE），开发了水样中氯磺隆和甲基甲磺隆的快速定量方法。本文以羧基功能化的MWCNTs为填料，制备新型的枪头式固相萃取（PT－SPE）小柱，结合高效液相色谱建立了饮用水中5种双酚类化合物的分离分析方法，并用于实际样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-2030高效液相色谱仪（日本岛津公司），KX1613T型超声清洗器（北京科玺世纪科技有限公司），TL80-1型高速离心机（江苏天力医疗器械有限公司），ATY124分析天平（日本岛津公司），1mL移液枪（大龙兴创实验仪器有限公司）。

双酚类化合物标准品：双酚A（BPA）、双酚E（BPE）、双酚F（BPF）、双酚Z（BPZ）、四甲基双酚A（TMBPA）（纯度≥98%，百灵威科技有限公司），甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、乙腈（ACN）（色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司），氨基化多壁碳纳米管（NH2－MWCNTs）、羧基化多壁碳纳米管（COOH－MWCNTs）、羟基化多壁碳纳米管（OH－MWCNTs）（纯度≥95%，长度8～15nm，南京先丰纳米材料科技有限公司）。

1.2 实验过程

1.2.1 标准溶液的配制分别准确称取BPA、BPE、BPF、BPZ、TMBPA的标准物质各10mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配成100mg/L的单标储备液，于4℃冰箱保存。

1.2.2 样品前处理 准确称取1.5 mg多壁碳纳米管，装填在两端塞有棉花的1mL移液枪枪头中，制成简易PT－SPE小柱，依次经3mL甲醇和3mL纯水活化平衡，备用。取5mL水样，调节其pH值为5，经PT－SPE小柱富集后，用3mL纯水冲洗残留在柱上的离子及强极性干扰物质，减少对目标化合物检测的影响，然后用0.5 mL甲醇洗脱目标化合物，待HPLC分析（图1）。

图1 PT－SPE小柱的操作流程图Fig.1 Schematic diagram of PT－SPE cartridge

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Shim－pack GIST C18（250mm×4.6 mm，5µm）；柱温：30℃；检测波长：230nm；流速：1.0 mL/min；进样量：5µL；流动相：ACN（A）和H2O（B）。梯度洗脱程序：0～5.0 min，35%B；5.0 ～10.0 min，35%～5%B；10.0 ～11.0 min，5%～35%B；11.0 ～15.0 min，35%B。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

考察了质量浓度为20mg/L的BPF、BPE、BPA、BPZ和TMBPA混合标样在不同流动相下的分离情况。结果表明，采用ACN－H2O（75∶25，体积比）为流动相进行等度洗脱时，由于流动相的洗脱能力太强，BPE和BPA未能实现基线分离。当采用ACN－H2O（65∶35）作为流动相时，所有化合物均能实现基线分离，但分析时间大于20min。为提高方法准确性和实验效率，确定采用“1.3 ”所示的梯度洗脱方式对双酚类化合物进行分离。5种双酚类化合物在13min内均实现了基线分离，峰形良好，无拖尾现象（图2）。

图2 5种双酚类化合物的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of five bisphenol compounds

2.2 固相萃取条件的优化

2.2.1 多壁碳纳米管种类的选择双酚类化合物在饮用水中的含量非常低，一般需经过富集才能被液相色谱仪检测。本文选取3种功能化的多壁碳纳米管（羧基化、氨基化和羟基化），按照“1.2.2 ”步骤制备PT－SPE小柱，5种双酚类化合物的添加水平均为110µg/L，上样量为5mL，考察多壁碳纳米管的种类对双酚类化合物富集效果的影响。结果表明，氨基化、羟基化、羧基化多壁碳纳米管的富集效率分别为14.8 %～64.7 %、53.9 %～80.0 %和73.9 %～95.8 %。羧基化多壁碳纳米管的富集效果明显较优，这可能与羧基化多壁碳纳米管与双酚类化合物之间有较强的π－π作用有关。因此，后续实验选择羧基化多壁碳纳米管作为富集材料。

2.2.2 羧基化多壁碳纳米管用量的选择羧基化多壁碳纳米管的用量会影响PT－SPE小柱对双酚类物质的吸附效率。其他实验条件保持不变，向1mL枪头中分别加入不同质量（0.5 ～2.0 mg）的羧基化多壁碳纳米管，考察5种双酚类化合物的回收率（图3）。结果显示，5种双酚类化合物的回收率随着羧基化多壁碳纳米管用量的增大呈先增加后降低的趋势，当其用量为1.5 mg时，5种化合物的回收率最高（76.4 %～99.6 %）。因此，选择羧基化多壁碳纳米管的用量为1.5 mg。

图3 羧基化多壁碳纳米管的用量对5种双酚类化合物回收率的影响Fig.3 Effect of amounts of COOH－MWCNTs on the recoveries of five bisphenol compounds

2.2.3 样品pH值的选择样品的pH值不仅影响双酚类化合物在色谱柱上的保留时间，也会影响多壁碳纳米管对双酚类化合物的吸附。选取甲酸和氨水调节水样的pH值，考察了pH值对样品回收率的影响（图4）。结果表明，pH值为3～5时，5种双酚类化合物的回收率随着pH值的升高而增加，在pH5时回收率达到最大。当pH值继续升高（pH5～7）时，回收率呈下降趋势。因此选择最佳pH值为5。

图4 不同pH值对双酚类化合物回收率的影响Fig.4 Effect of pH values on the recoveries of bisphe⁃nol compounds

2.2.4 洗脱剂种类的选择洗脱剂的种类也是固相萃取中影响回收率和富集倍数的重要因素之一。本文选择MeOH、EtOH、ACN、MeOH/H2O（50∶50，体积比）4种溶剂作为洗脱剂，考察其对双酚类化合物的洗脱效果。结果显示，当MeOH、EtOH、ACN、MeOH/H2O（50∶50）作为洗脱剂时，5种双酚类化合物的回收率分别为59.8 %～112%、20.1 %～77.9 %、8.6 %～32.8 %和67.9 %～102%。而4种溶剂的洗脱能力顺序为：MeOH＞MeOH/H2O（50∶50）＞EtOH＞ACN。与其他溶剂相比，甲醇的洗脱能力更好，这可能与甲醇更易与双酚类化合物形成分子间氢键有关。因此本文选择MeOH作为洗脱剂。

2.2.5 洗脱剂用量的选择洗脱剂用量不仅影响分析物的富集倍数，也会影响方法回收率。考察了甲醇用量（0.3 、0.5 、0.7 mL）对5种双酚类化合物回收率的影响。结果显示，甲醇用量为0.3 、0.5 、0.7 mL时，5种双酚类化合物的回收率分别为19.7 %～94.2 %、59.8 %～109%和40.7 %～87.3 %。由于本方法主要依靠液体重力进行洗脱，随着洗脱剂用量的增加，样品前处理的时间也随之延长。为获得较大的富集倍数和较短的洗脱时间，最终选择甲醇用量为0.5 mL。

2.3 竞争性吸附考察

5种双酚类化合物的化学结构相似，均具有苯环和酚羟基等官能团，与羧基化多壁碳纳米管有较强的π－π相互作用。由于羧基化多壁碳纳米管的化学结合位点有限，因此5种双酚类化合物在富集过程中可能存在一定的竞争关系。以5mL空白水样为考察对象，加标质量浓度均为110µg/L，实现发现添加BPF、BPE、BPA、BPZ和TMBPA的混合标样时，其平均回收率分别为101%、92.9 %、92.5 %、111%、59.8 %；而单独添加BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA标样时，其平均回收率分别为91.9 %、98.7 %、102%、99.9 %、102%。与添加单标相比，混合标样中TMBPA的回收率明显降低，而其他4种化合物的回收率无明显变化。这可能是因为TMBPA苯环上的甲基较多，空间位阻较大，影响了苯环与羧基化多壁碳纳米管的π－π相互作用。与其他4种化合物相比，TMBPA的竞争性吸附能力较弱。

2.4 选择性考察

选择性是固相萃取抗干扰能力的重要性能。在样品筛选中，考察了邻苯二甲酸酯、苯酚、苯胺以及萘等化合物（质量浓度均为100µg/L），结果发现羧基化多壁碳纳米管对邻苯二甲酸酯、苯酚、苯胺无明显的富集效果，但对萘的富集效果良好，回收率达到70%以上。这可能是因为邻苯二甲酸酯、苯酚、苯胺等化合物只有1个苯环，与羧基化多壁碳纳米管的π－π相互作用较弱，不能有效富集。而萘与双酚类化合物均有2个苯环，π电子较多，与羧基化多壁碳纳米管π－π相互作用较强，富集效果良好。上述结果表明，羧基化多壁碳纳米管对含有多个苯环的化合物具有良好的选择性。

2.5 分析方法的评价

2.5.1 线性关系、检出限及回收率用初始流动相（65%乙腈水溶液）配制质量浓度分别为2.2 、11、22、110、220µg/L的5种双酚类化合物标准溶液，采用本方法进行检测，以其质量浓度作为横坐标（x，µg/L），以峰面积作为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数（见表1）。结果显示，5种化合物在2.2 ～220µg/L质量浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，相关系数r≥0.9985 。按照优化的样品前处理和色谱条件进行实验，以3倍信噪比对应的空白样品添加浓度为方法检出限（MDL），BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA的MDL分别为0.050 、0.022 、0.005 、0.031 、0.097 µg/L。

表1 本方法的线性关系、方法检出限、回收率及相对标准偏差Table1 Linear relations，MDLs，recoveries and RSDs of this proposed method

在空白瓶装水样中，分别添加BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA标样，加标水平为22、110、220µg/L，每个浓度做3次平行实验，考察方法的回收率。结果表明，BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA的平均回收率为91.1 %～110%，相对标准偏差（RSD）为0.20 %～4.3 %，说明该方法准确、稳定。

2.5.2 重现性及稳定性在相同实验条件下，平行制备3个PT－SPE小柱，对5种双酚类化合物加标浓度均为44µg/L的自来水样品进行测定，其回收率的RSD为8.1 %～16%，表明此PT－SPE小柱具有良好的重现性。使用同一PT－SPE小柱对自来水样品进行平行测定，日内（n=9）和日间（n=3）RSD分别为1.2 %～5.9 %、2.9 %～5.6 %，表明该PT－SPE小柱具有良好的稳定性。

2.6 与文献报道方法的比较

将本方法与文献报道的分析方法比较，结果见表2。与文献方法相比，本方法的PT－SPE小柱制备简单，且分析方法的检出限较低（5～97ng/L），适用于水样中双酚类化合物的快速检测。

表2 不同分析方法测定双酚类化合物的对比Table2 Comparison of different analytical methods for BPs determination

2.7 实际样品测定

在本地市场购买了5种不同品牌的塑料瓶装饮用水，按照本方法进行处理和检测。5种饮用水中均未检出BPF、BPE、BPA、BPZ、TMBPA。结果表明，本方法简单快捷，可以满足饮用水中双酚类化合物的快速定性与定量检测要求。

3 结 论

本文以羧基化多壁碳纳米管为固相萃取吸附剂，制备了新型的PT－SPE小柱，结合高效液相色谱对饮用水中5种双酚类化合物进行快速定量检测。通过考察碳纳米管的种类和用量、样品溶液的pH值、洗脱剂的种类和用量等对方法回收率的影响，确定了最佳实验条件。与文献报道的方法相比，本方法的检出限和实验成本较低，可满足现行法规和饮用水中双酚类化合物的痕量检测需求。