QuEChERS/气相色谱－串联质谱法测定乳制品中232种农药残留

王 敬，张海超，陈敏娜，艾连峰，张亦琴

（石家庄海关技术中心，河北 石家庄 050051）

乳制品是高营养食品，不仅含有丰富的脂肪、蛋白质和碳水化合物，还含有人体必需的维生素和微量元素，已成为人们日常消费最多的食品之一。而乳制品中农药残留是影响乳品安全的因素之一，尤其乳制品产业链长，农药残留可通过食物链蓄积，进而对人体造成长期、微剂量及慢性细微毒性效应。这种毒性效应起病缓慢、持续期长、涉及面广、影响人数多，可在人体生理、自身免疫功能、致癌、致畸及致突变等方面反映出来［1－4］。乳品中农药残留主要是因为奶牛进食了被农药污染的饲料，或在使用杀虫剂控制奶牛身上的真菌、细菌、线虫等及周围的苍蝇、蚊虫时混入奶中，挤奶设备、用具及其它牛奶接触到的物品也均可能产生残留。我国以及欧盟、日本、美国和中国香港等国家和地区不断修订乳及乳制品中杀虫剂、除草剂和杀菌剂等农药的最高残留限量（MRLs）。其中，中国香港《食物内除害剂残余规例》制定了牛奶中142种农药残留限量；欧盟制定了乳品中460多种农药残留限量；美国制定了牛奶中190余种农药残留限量；澳大利亚制定了牛奶中227种农药残留限量；日本制定了牛奶中373种农药残留限量［4］。2020年2月15日实施的GB2763－2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》［5］规定了109种农药在肉、蛋、奶等动物源性农产品中的703项农药最大残留限量，其中杀扑磷低至0.001 mg/kg，七氯和艾氏剂均为0.006 mg/kg，嘧菌环胺更是低至0.0004 mg/kg。

近年来，我国有关机构对于乳制品中农药残留的监管力度不断加大。已颁布的GB23200.86－2016、GB23200.90－2016和GB23200.85－2016［6－8］等国家标准大多只检测一种或一类农药残留，覆盖范围窄；GB/T23210－2008［9］虽然涉及农药面广，但前处理方法较为繁琐，基质单一，且由于采用GC－MS测定，许多农药的检出限无法满足GB2763－2019的限量要求。为了更好地满足市场需求，乳制品中农药多残留快速检测的方法研究已逐渐成为热点。乳制品组成成分较多，主要的基质干扰成分有脂肪、磷脂、蛋白质、糖类等，常用液液萃取法、凝胶渗透法、固相萃取法、低温冷冻除脂法和QuEChERS法等前处理方法［4，10－15］。其中，QuEChERS法具有操作简单、快速、实用、高效等优点，可满足快速处理大批量农药残留样品的需求。

GB2763－2019国家强制性标准自发布以来，对食品行业从种植（养殖）、加工直至餐桌消费整个闭环产生了巨大影响。已有文献研究了牛奶中农药残留，但对GB2763－2019规定的乳制品中农药残留分析研究尚未见报道。本文在前期研究基础上［4］，对GB2763－2019中涉及的多数农药进行了分析研究，涉及农药种类占全部总限量数的54%。采用具有较好选择性和灵敏度的气相色谱－质谱/质谱仪结合QuEChERS净化技术，并优化前处理方法和仪器上机条件，建立了气相色谱－串联质谱法同时检测乳制品中232种农药多残留的分析方法，为推进乳品中农药残留相关检测标准的制定提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TRACE1310－TSQ8000Evo气相色谱三重四极杆串联质谱仪、TG－5SilMS气相色谱柱（30mm×0.25 mm×0.25 µm）（美国Thermo Fisher Scientific公司）；电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Turbo Vap LV型氮吹浓缩仪（Zymark公司）；ALLEGRA X－15R型离心机（美国Beckman公司）；Milli-Q纯化系统（Millipore公司）。

232种农药标准物质及环氧七氯内标（Dr.Ehrenstorfer和Sigma公司）；乙腈、乙酸、丙酮、正己烷均为色谱纯（美国Dikma公司）；无水硫酸镁（分析纯，广州化学试剂厂）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（GCB）购自美国Dikma公司。

供试样品：牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、原料奶和奶酪采购于本地市场。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准储备液的配制：称取约5～10mg（精确至0.1 mg）各农药标准品分别置于10mL容量瓶中，根据各物质的溶解性选用甲苯或丙酮溶解并定容至刻度，于－20℃冰箱中保存。混合标准溶液的配制：移取一定量各农药标准储备液于100mL容量瓶中，用丙酮－正己烷（体积比1∶1，下同）定容并配成100µg/mL的混合标准工作液，于－20℃冰箱中保存。内标溶液：准确称取环氧七氯（内标），用丙酮－正己烷（1∶1）逐级稀释成20µg/mL的内标溶液，于－20℃冰箱中保存。基质空白标准溶液：准确吸取适量混合标准工作液，用样品空白提取液配成系列基质空白标准溶液，现用现配。

1.2.2 样品前处理 液体乳制品：称取试样约10g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，准确加入15mL1%乙酸乙腈、6g无水硫酸镁、1.5 g无水醋酸钠及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1min后以5000r/min离心5min，吸取5mL上清液加入内含900mg无水MgSO4、50mg C18和50mg PSA的离心管中，涡旋混匀1min，以5000r/min离心5min。准确吸取3mL上述离心后的上清液于10mL试管中，于40℃氮气吹至近干，用丙酮－正己烷（1∶1）定容至1mL，加入10µL内标溶液，超声溶解30s，过0.22 µm有机相滤膜，待测定。

固体乳制品：称取试样5g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加入10mL40～45℃水重复溶解并浸泡30min，再加入15mL1%乙酸乙腈、6g无水硫酸镁、1.5 g无水醋酸钠及1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1min后以5000r/min离心5min，吸取5mL上清液加入内含900mg无水MgSO4、50mg C18和50mg PSA的离心管中，涡旋混匀1min，以5000r/min离心5min。准确吸取3mL上述离心后的上清液于10mL试管中，于40℃氮气吹至近干，用丙酮－正己烷（1∶1）定容至1mL，加入10µL内标溶液，超声溶解30s，过0.22 µm有机相滤膜，待测定。

1.2.3 气相色谱条件 色谱柱：TG－5silMS气相色谱柱（30mm×0.25 mm×0.25 µm）；程序升温：50℃保持1min，以30℃/min升至130℃，再以6℃/min升至280℃，最后以10℃/min升至310℃，保持5min；载气：高纯氦气（纯度≥99.999 %）；流速：1.30 mL/min，恒流；进样口温度：290℃；进样量：1µL；进样方式：不分流进样，1.5 min后打开分流阀。

1.2.4 质谱条件离子源：电子轰击源（EI）；离子源温度：250℃；四极杆温度：150℃；GC－MS/MS接口温度：280℃。溶剂延迟时间：10min；碰撞气为氩气，流速1.5 mL/min，猝灭气为氦气（He），流速2.25 mL/min。多反应离子监测模式（T－MRM），每个农药选取2对特征MRM反应，其中一个作为定量离子对，一个作为定性离子对。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

由于考察农药覆盖了有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、杂环类等极性和溶解度差异较大的多种类农药，要求提取溶剂对目标物具有足够的溶解性和稳定性。因此，实验比较了乙腈、丙酮、丙酮+乙酸乙酯、丙酮+正己烷4组试剂对232种农药的提取效率（表1）。结果发现：用丙酮、丙酮+正己烷提取时，部分农药回收率低；用丙酮+乙酸乙酯提取时，脂溶性杂质较多，提取液颜色较深，不利于后续净化。乙腈渗透性强，适用于提取极性范围较宽的农药，对乳制品中脂类杂质提取效率低，并可迅速沉淀蛋白，对于牛奶、羊奶等含水量较高的样品可直接提取；但对于含水量较低的乳粉等样品，采用乙腈直接提取时的平均回收率低于60%，因此需在提取前加水浸泡，促使样品溶胀，提高提取效率；同时加入乙酸酸化，避免百菌清、异菌脲、苯线磷等碱性或中性环境下不稳定农药的降解和损失［16］。由于百菌清结构式中的甲腈基团与样品基质相互作用［17］，导致回收率偏低，加入少量乙酸可破坏这种作用力，从而提高回收率。实验考察了乙酸体积分数分别为0.5 %、1%、2%、5%对目标物提取效率的影响。结果发现：当乙酸体积分数为0.5 %时，目标物的提取率偏低，当乙酸体积分数为1%、2%和5%时均可获得较高的提取率，但随着乙酸体积分数的增加，其他共萃取质子化的概率也会增加，不利于样品净化。因此，选取1%乙酸乙腈为提取溶剂。采用涡旋混匀提取乳粉样品时，难以破坏蛋白沉淀层致使提取不完全，且无水硫酸镁遇水易结块，加入陶瓷均质子可避免无水硫酸镁结块影响除水效果和消除因沉淀包裹目标物造成的回收率降低。陶瓷均质子两侧为斜切面的圆柱体，可在振荡过程中通过剪切力将样品和结块的无水硫酸镁进一步切碎混匀，增大了样品和提取溶剂的接触面积，提高了提取效率。

表1 不同提取溶剂对牛奶中232种农药的添加回收率统计（n=3）Table1 Spiked recoveries of232pesticides in milk extract with different extraction solvents（n=3）

2.2 净化条件的优化

乳及乳制品基质比较复杂，含有大量脂肪、蛋白质和磷脂，乳粉中还含有大量的糖，且方法涉及农药种类及数量较多，因此需去除蛋白质、脂肪等干扰物［17］。尽管脂肪不溶于乙腈提取剂，但提取过程中仍会携带出少量脂肪。QuEChERS方法常用的净化剂有PSA、C18、GCB、无水MgSO4等。无水MgSO4可以去除提取液中的水分，但提取后直接加入会立即剧烈放热，不利于热不稳定农药的检测，加完后立即剧烈振荡可减少结块和放热对提取效率的影响。PSA可去除样本基质中的脂肪酸、糖等极性杂质，C18能吸附基质中部分非极性脂肪和脂溶性杂质，GCB能够去除色素和固醇类杂质，但对百菌清、六氯苯等平面结构的农药具有一定的吸附［18］，实验参考了食品安全国家标准GB23200.113－2018［19］，对净化步骤进行了优化，最终选定PSA、C18和无水MgSO4为净化剂。考察了不同配比的PSA和C18的净化效果。取1.5 mL提取液，固定加入20mg PSA，分别比较了C18添加量为10、30、50、70mg对回收率的影响，发现C18添加量为50mg时各农药的回收率最高；固定加入50mg C18，分别比较了PSA添加量为10、30、50、70mg对回收率的影响，发现PSA添加量为50mg时各农药的回收率最高。因此，实验最终选择向提取液中加入900mg无水MgSO4、50mg C18和50mg PSA，并立即涡旋振荡1min。

2.3 质谱条件的优化

对232种农药的混合标准溶液在m/z30～500范围内进行全扫描，使用NIST标准库匹配检索，确定目标物的保留时间，并对目标物的前级离子、产物离子、碰撞能量等一系列质谱参数进行了优化。与传统的多反应监测模式（MRM）相比，T－MRM可对每种组分的保留时间窗口进行动态分配，检测多种目标物无需分时间段，可简化分析流程，提高分析效率，适合进行农药多残留分析。图1为优化条件下232种农药的总离子流（TIC）图。

图1 232种农药混合标准溶液的TIC图Fig.1 TIC chromatogram of232pesticides in two groups

2.4 内标的选择

为了提高方法的准确度、保持良好的重复性，尽可能地减少或消除仪器操作条件造成的系统误差，以及消除EI源在离子化过程中的变化，采用内标法定量。内标应与待测组分基本相同或尽可能一致的物理化学性质，在分析过程中有良好的稳定性，且具有较高的质谱响应。实验考察了环氧七氯、多氯联苯（PCB198）、磷酸三苯酯作为内标对定量的影响。结果发现，以环氧七氯为内标时效果最好，且具有很好的稳定性和较高的质谱响应［9，19－22］，因此选择环氧七氯为内标进行定量分析。

2.5 基质效应

基质效应（ME，%）=（基质匹配标准曲线的斜率/纯溶剂标准曲线的斜率－1）×100%，ME小于20%为弱基质效应；ME在20%～50%范围内为中等基质效应；ME大于50%为强基质效应［23－24］，232种农药在不同乳品中的基质效应结果如图2所示。由图可见，不同样品基质中，至少有60%的分析物响应信号增强，固体乳品中农药的基质效应普遍大于液体乳品，其中，奶粉基质对31%的农药表现为强基质效应，即72种农药的ME均大于50%。这是由于同一目标物在不同基质中基质效应的大小不同所致，因此需使用与测定样品基质相一致的基质匹配标准溶液进行校正。由于基质效应的产生原因复杂、来源多样，因而难以根本去除基质效应的影响［25］。目前，减少基质效应影响的方法一般有加入同位素标记的目标物，增加净化步骤或进样前稀释，基质匹配标准溶液，分析物保护剂的加入等［4，26－28］。本方法采用基质匹配标准溶液进行测定，能够很好地解决峰形较宽，保留时间漂移的问题，基本抵消了基质效应的干扰。

图2 232种农药（20µg/kg）在不同乳品中的基质效应Fig.2 Matrix－effects of232pesticides（20µg/kg）in different milk products

2.6 线性关系、定量下限、回收率及相对标准偏差

实验选取空白牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、原料奶和奶酪样品基质的提取液（按“1.2.2”方法制备），配制不同质量浓度的农药基质标准溶液，以环氧七氯为内标，进行线性回归。结果表明，嘧菌环胺在0.2 ～4.0 µg/L，杀扑磷、氯丹、六六六和滴滴涕在0.5 ～10.0 µg/L，丙硫菌唑、七氯、艾氏剂、苯线磷、狄氏剂、异狄氏剂在1.0 ～20.0 µg/L，百菌清在20～400µg/L，其余212种农药在5～100µg/L范围内呈线性关系，相关系数（r）均大于0.99。按照组分的T－MRM离子峰信噪比S/N≥10，得到乳制品中232种农药的定量下限（LOQ）为0.0004 ～0.05 mg/kg，除百菌清LOQ为0.05 mg/kg，其他农药LOQ均不高于0.01 mg/kg，满足GB2763－2019的限量要求。

在阴性牛奶样品中分别添加0.01 、0.02 、0.10 mg/kg的232种农药混合标准溶液，静置30min，待农药被样品充分吸收后，按“1.2.2”方法处理并进行回收实验，每个添加水平重复6次，计算相对标准偏差（RSD），结果见表2。结果表明，232种农药在牛奶中的平均回收率为65.2%～110%，RSD为3.6 %～13%，完全满足国内外对乳品检测的要求。

表2 232种农药的保留时间、离子对、相关系数（r）、定量下限（LOQ）、平均回收率及相对标准偏差（n=6）Table2 Retention times，characteristics ions，correlation coefficients（r），LOQs，average recoveries（R）and RSDs（n=6）of the232pesticides

(续表2)

(续表2)

(续表2)

(续表2)

2.7 实际样品检测

将建立的方法应用于市售280批次乳制品（包括90批次原料奶、70批次牛奶、10批次羊奶、62批次酸奶、40批次奶粉和8批次奶酪）中232种农药残留的监测，结果在4份原料奶检出六六六，含量为1.7 ～7.6 µg/kg，7份原料奶检出滴滴涕，含量为1.3 ～4.8 µg/kg，其它农药均未检出。根据GB2763－2019奶中六六六和滴滴涕的残留限量均≤0.02 mg/kg，表明二者残留量较低，未超过国家卫生标准限值。

由于有机氯农药被降解需30年之久，原料乳中仍偶有检出，因此，乳品中农药残留仍需得到足够重视，进行长期监测。

3 结 论

本文对乳制品中农药多残留的前处理方法和检测技术进行了深入研究，采用QuEChERS法结合气相色谱－串联质谱建立了一种简单、快速、高效且能同时准确定性和定量检测乳制品中232种农药残留的方法。该方法涵盖农药种类全，同时对不同种类的样品基质进行考察，进一步加强了方法的适用性，且定量下限同时满足国家标准和欧盟等国家和地区的检测要求，为乳制品的日常检测提供了有力的技术支持。