一种基于1，4-亲核加成反应的新型荧光探针及其在食品和活细胞中的应用

张春香，唐斯萍，李雯倩，申有名，谷 标*

（1.湖南文理学院 化学与材料工程学院，湖南 常德 415000；2.衡阳师范学院 化学与材料科学学院，功能金属有机化合物湖南省高校重点实验室，湖南 衡阳 421008）

亚硫酸盐（SO2−3）是一种强还原剂，广泛用作食品添加剂，可防止食品氧化和维持食物颜色光鲜亮丽［1］。此外，一定量的亚硫酸盐会阻碍微生物正常的生理氧化过程并抑制微生物的增殖［2］。因此，亚硫酸盐在农副产品加工中常被用作防腐剂和漂白剂。研究表明，摄入过量的亚硫酸盐会导致呼吸系统疾病、心血管疾病、肺癌及多种神经性疾病［3］。鉴于亚硫酸盐的有害影响，世界卫生组织建议人体摄入亚硫酸盐水平应低于0.7 mg/kg［4］。因此，发展可靠、有效的方法来检测食品和生物体内亚硫酸盐具有重要意义。

目前已有的亚硫酸盐检测方法包括流动注射法［5］、电化学法［6］、毛细管电泳分析［7］和其他方法［8－9］。然而，这些方法存在操作复杂、仪器昂贵、侵入性或破坏性检测等问题，很难用于生物体内亚硫酸盐的检测。相比之下，荧光探针，特别是具有比色和荧光双重响应的探针，由于观察方便、样品预处理简单、适用于实时监测和生物成像分析等优点，被视为分析物检测的有力工具［10－11］。迄今为止，已经报道了许多亚硫酸盐荧光探针［12－15］。根据反应机理，主要分为基于氢键形成［16］、乙酰丙酸酯的选择性去保护［17］和亲核加成反应［18］的亚硫酸盐荧光探针3类。尽管报道的荧光探针在亚硫酸盐检测和成像方面取得了一定成就，但仍存在一些问题。例如，基于氢键形成机理的亚硫酸盐探针容易受到溶剂与亚硫酸盐之间氢键的干扰，在检测中的选择性和灵敏性不尽人意［19－20］。基于乙酰丙酸酯去保护反应机理的探针被报道能与水合肼反应［21］，产生相同的荧光响应，对亚硫酸盐检测存在潜在干扰。此外，一些探针检测时间长、水溶性差，难以满足实时检测及生物成像要求［22］。因此，开发快速响应、灵敏性和选择性高、适于亚硫酸盐检测和成像的荧光探针尤为重要。

本研究设计并合成了一种新型亚硫酸盐荧光探针CQ（见图1）。探针CQ通过乙烯桥键将N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐片段与4-氰基苯乙腈片段连接。其中，N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐片段不仅能与亚硫酸盐发生1，4-亲核加成反应，作为亚硫酸盐的特异性识别位点，还能提高整个探针分子的水溶性。在与亚硫酸盐作用前，探针CQ内具有拉电子性质的N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐与4-氰基苯乙腈片段形成“拉－拉”电子体系，分子内电子转移过程（ICT）受阻，荧光较弱。与亚硫酸盐作用后，N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐片段由拉电子性质变为推电子性质，在探针CQ内形成“推－拉”电子体系，ICT过程开启，荧光恢复。结果表明探针CQ对亚硫酸盐识别具有比色和荧光双重响应、反应迅速、灵敏性和选择性高的特点。更重要的是，该探针不仅可用于食品中亚硫酸盐的定量分析，还可用于HeLa细胞内亚硫酸盐的可视化成像，有望在食品监测及生物传感领域得到广泛应用。

图1 探针CQ合成路径图Fig.1 Synthesis route of probe CQ

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Bruker AVANCE－400MHz型核磁共振波谱仪（甲基硅烷（TMS）为内标），UV－2600型紫外可见分光光度计、RF－5301PC型荧光分光光度计（Shimazu Co，Japan），FluoView FV1200MPE奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜。

4-氰基苯乙腈、3-喹啉甲醛、三氟甲基磺酸甲酯和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购于安耐吉化学有限公司。其他分析纯试剂购于国药集团化学试剂（上海）有限公司。

1.2 探针CQ的合成

化合物1的合成与表征：将4-氰基苯乙腈（284.3 mg，2.0 mmol）和3-喹啉甲醛（314.3 mg，2.0 mmol）置于一洁净的圆底烧瓶（50mL）中，向其中加入哌啶（100µL）和乙醇（20mL），随后将圆底烧瓶于50℃油浴锅中搅拌反应12h。待反应结束后，有白色固体析出。反应混合液经过滤、水洗后，得到纯净的化合物1（517.6 mg，92%）。1H NMR（400MHz，DMSO－D6）：δ9.33 （d，J=2.1 Hz，1H），8.96 （d，J=1.5 Hz，1H），8.51 （s，1H），8.11 （t，J=7.7 Hz，2H），8.08－8.00 （m，4H），7.91 （dd，J=11.7 ，4.5 Hz，1H），7.73 （t，J=7.5 Hz，1H）；13C NMR（101MHz，DMSO−D6）：δ151.19 ，148.33 ，143.19 ，138.28 ，136.76 ，133.69 ，132.10 ，129.58 ，129.33 ，128.27 ，127.35 ，127.21 ，118.87 ，117.62 ，112.29 ，111.55 。

探针CQ的合成与表征：将化合物1（281.3 mg，1.0 mmol）和三氟甲基磺酸甲酯（197.0 mg，1.2 mmol）溶解于10mL三氯甲烷中，将混合物室温下搅拌反应12h。待反应结束后，有淡黄色沉淀物质生成。经过滤、干燥，得到纯净的探针CQ（368.2 mg，83%）。1H NMR（400MHz，DMSO－D6）：δ9.87 （s，1H），9.75 （s，1H），8.61－8.59 （d，J=8.4 ，2H），8.54 （s，1H），8.41－8.37 （m，1H），8.17－8.11 （m，3H），8.06－8.04 （d，J=8.4 ，2H），4.71 （s，3H）；13C NMR（101MHz，DMSOD6）：δ151.35 ，145.45 ，139.44 ，138.56 ，137.30 ，137.19 ，133.95 ，131.62 ，131.33 ，129.09 ，128.07 ，127.47 ，119.99 ，116.53 ，115.57 ，113.20 ，46.50 。

1.3 光谱测试

以色谱纯DMF为溶剂，配制浓度为1mmol/L的探针CQ储备液。以去离子水为溶剂，分别配制浓度为1mmol/L的Na2SO3储备液和10mmol/L其他干扰物质（Zn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Al3+、I－、F－、AcO－、Cl－、N、NO2－、H2PO4－、C－、ClO3－、S2－、SCN－、S－、Hcy、Cys、GSH、N2H4、H2O2、ClO−、S）溶液。样品溶液的配制：取若干个2mL的测试管，依次加入20µL CQ储备液（1mmol/L）、180µL DMF和Na2SO3或者其他干扰物质储备液，用PBS溶液（20mmol/L，pH7.4）定容，放置2min后进行光谱测试。

1.4 食品中亚硫酸盐的检测

用于实际样品分析的白砂糖、石冰糖和红酒购于附近超市。糖类样品溶液配制：准确称取2.5 g白砂糖和石冰糖，分别用去离子水溶解，定容至10.00 mL。红酒样品溶液配制：准确移取1mL红酒，用去离子水稀释，定容至100.00 mL。样品测试方法：用移液枪准确移取一定体积的样品溶液放置在2mL的测试管中，再依次加入20µL CQ储备液（1mmol/L）和180µL DMF，最后用PBS溶液（20mmol/L，pH 7.4）稀释至刻度。待样品溶液孵育2min后，转移至比色皿（1cm）中，通过荧光光谱仪测试其发射光谱并记录511nm处的荧光强度。回收率实验：向样品溶液中添加不同且已知浓度的Na2SO3标准液（1.0 µmol/L或2.0 µmol/L），利用探针CQ测定加标后样品中亚硫酸盐的总含量及回收率。

1.5 细胞成像

取对数生长期的HeLa细胞（人宫颈癌细胞），稀释成2.0 ×104cell/mL的细胞悬液，接种于培养皿中，使之生长24h。待细胞贴壁生长后，移除培养基，用温热（37℃）的PBS缓冲液冲洗3次。在细胞成像之前，首先取一部分HeLa细胞，放置在含有探针CQ（10µmol/L）的DMEM培养液（10%小牛胚胎血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基）中，使之在37℃，5%CO2的培养箱中生长30min。用温热的PBS缓冲液冲洗细胞外残留的探针CQ，在激光共聚焦显微镜下观察并拍摄细胞的明场和荧光图。另取一部分HeLa细胞与探针CQ（10µmol/L）共孵育30min后，继续与Na2SO3（10µmol/L）共孵育5min。经PBS缓冲液冲洗后进行细胞成像。

2 结果与讨论

2.1 光谱表征

在合成探针CQ后，通过紫外－可见吸收光谱仪和荧光光谱仪测试其在PBS溶液（DMF∶H2O=1∶9，体积比，pH7.4）中对亚硫酸盐的识别性能。如图2所示，探针CQ在335nm处有一个紫外吸收峰。加入亚硫酸盐后，335nm处的吸收峰消失，同时在442nm处产生一个强的紫外吸收峰，表明探针CQ与亚硫酸盐发生化学反应生成了一种新的物质。向探针CQ溶液中加入亚硫酸盐后，溶液颜色由无色变成黄色。以最大吸收波长335nm为激发波长测得探针CQ的荧光发射波长为447nm。采用442nm的激发波长测定探针CQ的荧光光谱时，其荧光强度较弱，发射光谱几乎呈一条直线；加入亚硫酸盐后，探针CQ在511nm处出现一个明显的发射峰，其荧光强度增加35倍。上述实验结果表明，探针CQ可作为一种亚硫酸盐的比色/荧光传感器。

2.2 反应机理

基于探针CQ与亚硫酸盐作用前后的紫外及荧光光谱变化，推测探针CQ中的N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐与亚硫酸盐发生亲核加成反应，使光谱发生相应变化。为证实这一猜测，借助核磁共振仪对探针CQ与亚硫酸盐反应前后的氢谱进行监测。实验结果如图3所示，与亚硫酸盐反应后，探针CQ中N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐上的芳氢（N原子对位的氢）和甲基氢分别向高场移动（芳氢从9.67 移动到5.58 ，甲基氢从4.65 移动到3.36 ），表明亚硫酸盐与N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐发生1，4-迈克尔加成反应。因此，提出如下识别机理（图4）：具有亲核性的亚硫酸盐通过1，4-迈克尔加成反应攻击探针CQ上的N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐片段，生成荧光产物CQ－SO32－。在探针CQ与亚硫酸反应后，具有拉电子性质的N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐转变成推电子性质的片段，与具有拉电子性质的4-氰基苯乙腈片段形成“推－拉”电子结构，使分子内ICT过程开启，最终导致紫外和荧光增强，溶液由无色变成黄色。

2.3 条件优化

为了准确检测亚硫酸盐，对检测条件（包括pH值和反应时间）进行了优化。图5A展示了探针CQ在不同pH值条件下对亚硫酸盐的荧光响应情况。可以看到探针在整个pH值范围内荧光微弱，荧光强度变化很小，表明探针具有较好的稳定性。然而，在加入亚硫酸盐后，探针溶液在pH6.0 ～10.0 范围内有明显的荧光增强。考虑到后续生物成像应用，选择测试溶液的pH值为7.4。反应时间对亚硫酸盐检测的影响如图5B所示，可以看到探针与亚硫酸盐混合后，荧光强度迅速增加，并在20s内达到平衡。如此快的反应速度使探针能够实时监测亚硫酸盐。

2.4 灵敏性及选择性

在PBS溶液（DMF∶H2O=1∶9，体积比，pH7.4）中，控制探针CQ浓度为10µmol/L，通过改变SO32－的浓度（0～10µmol/L），测定体系荧光光谱的变化情况。发现在探针CQ溶液中加入SO32－后，体系在511nm处的荧光强度（Y）与SO32－的浓度（X，0～10µmol/L）呈现良好的线性关系，线性方程为Y=74.1148 X+21.7276 ，R2=0.9972 。根据检出限（DL）计算公式（DL=3σ/k，σ为空白样品连续测定11次后的标准偏差，k为标准曲线斜率）［23］，得到探针CQ对亚硫酸盐的检出限为25nmol/L。

为了考察探针CQ的选择性，测试了其在不同分析物存在下的荧光光谱。选定的干扰物主要包括一些常见的与环境和生物相关的离子（Zn2+、Cu2+、K+、Fe3+、Al3+、I－、F－、AcO－、Cl－、NO3－、NO2－、H2PO4－、CO32－、ClO3－、S2－、SCN－、SO42－）、水合肼（N2H4）、含巯基的氨基酸（Hcy、Cys、GSH）以及氧化物种（H2O2、ClO－）。由图6可见，向探针CQ溶液中加入亚硫酸盐后，511nm处的荧光强度明显增加，而加入其他分析物质后，荧光强度几乎无变化，表明探针CQ对亚硫酸盐具有较好的选择性，可用于亚硫酸盐的定性和定量分析。

2.5 实际样品分析

鉴于探针CQ优异的识别性能，进一步考察了其检测实际样品中亚硫酸盐的可行性。3种食物样品白砂糖、石冰糖和红酒购于附近超市，经预处理之后，采用标准回收率方法测试样品溶液中的亚硫酸盐含量，即：先向样品溶液中加入不同且已知浓度的Na2SO3标准液（1.0 µmol/L或2.0 µmol/L），测定其荧光光谱，将测得的荧光强度（I511nm）代入标准曲线方程计算亚硫酸盐含量。分析结果如表1所示，Na2SO3的加标回收率为96.7%～105%，表明探针CQ可用于食品中亚硫酸盐的定量分析，具有良好的实用价值。此外，分别用探针CQ和常规滴定法测试了样品溶液中亚硫酸盐的含量。由于红酒自身的颜色干扰滴定终点的判断，所以本实验选择衬度高的糖样品溶液进行滴定实验。结果如表2所示，可以看到本方法测得的亚硫酸盐的浓度与常规滴定法的测定结果基本一致，表明本方法具有较高的准确性。

表1 食品样品中Na2SO3的测定Table1 Detection results of Na2SO3in food samples

表2 不同方法测定食品中Na2SO3浓度的结果Table2 Results for Na2SO3in food samples detected by the probe CQ and direct iodometric method

2.6 细胞成像

为了探究探针CQ在生物体内的潜在应用能力，进行了细胞荧光成像实验。结果如图7所示，当HeLa细胞与探针CQ（10µmol/L）于37℃下共孵育30min后，在荧光显微镜下观察不到任何荧光信号（图7A下图）。然而，当HeLa细胞与探针CQ（10µmol/L）共孵育30min，再与Na2SO3（10µmol/L）共孵育5min后，可以观察到细胞内部有明显的绿色荧光（图7B下图）。说明探针CQ与细胞内的Na2SO3发生了1，4-迈克尔加成反应，释放荧光信号。通过明场图（图7A和7B上图），可以看到细胞结构完整，状态正常，表明探针CQ具有较好的生物相容性。上述实验表明探针CQ可用于活细胞内亚硫酸盐的可视化成像。

2.7 与已有探针的比较

将当前探针与其他HSO3－/SO32－荧光探针进行比较。从表3可知，探针CQ对亚硫酸盐检测具有反应迅速、水溶性好、灵敏性和选择性高的特点。这主要是因为本研究构建的探针是以N-甲基喹啉三氟甲磺酸盐为亚硫酸盐的特异性识别位点，不仅能赋予探针较高的选择性和灵敏性，还能提高整个探针分子的水溶性。

表3 CQ与其他HSO3－/SO32－荧光探针的比较Table3 The comparison of CQ with other fluorescence probes for HSO3－/SO32－

3 结 论

本文基于1，4-迈克尔加成反应机理，研制了一种兼具比色和荧光响应的亚硫酸盐探针CQ。该探针对亚硫酸盐具有响应快、灵敏性和选择性高的特点。在实际应用方面，探针CQ不仅可用于食品中亚硫酸盐的定量分析，还可用于活细胞内亚硫酸盐的荧光成像。因此，本研究为食品样品和生命系统中亚硫酸盐的检测提供了一种有效、方便的工具。