依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞ER和PCNA表达的影响

于书娟 刘洪臣

依普黄酮（ipriflavone，IP）作为一种植物类雌激素，虽然具有雌激素的作用，但对子宫内膜的刺激作用较小［1］，其较好的骨质疏松症的疗效和较小的副作用得到了医生和患者的推崇［2］。另外，骨质疏松症和口腔医学有着密切的关系。有文献报道骨质疏松症患者出现水平牙槽骨缺损的风险显著增高（4.46倍）［3］。骨质疏松改变可使大鼠种植体骨界面骨形成蛋白2 含量明显降低［4］。并且，雌激素受体（estrogen receptor，ER）与骨质疏松关系最为密切［5］；而增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在细胞增殖的启动上作用重大，缺乏或低水平的功能性PCNA可能会促使细胞凋亡［6，7］，同时，通过检测去势大鼠骨痂标本的免疫组化，发现局部应用辛伐他汀可促进骨折愈合过程中细胞PCNA 的增加［8］。文献中对于ER和PCNA共同的研究主要集中在与雌激素密切相关的子宫内膜增生、乳腺癌和甲状腺癌等中［9］，但是对于ER和PCNA在同样与雌激素相关的骨质疏松中的表达情况未见相关报道，对于依普黄酮作用于骨质疏松症颌骨来源的成骨细胞时，ER和PCNA的表达情况，也未见相关报道。所以，本实验通过研究依普黄酮对骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞ER和PCNA表达的影响，了解依普黄酮对骨质疏松颌骨成骨细胞的可能作用机理。

1.材料和方法

1.1 主要试剂和材料 依普黄酮、DMEM 培养基及胎牛血清、胰蛋白酶和辣根酶过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG分别购于美国的Sigma公司、Gibco 公司、Amresco 公司和Santa 公司，新生牛血清购于杭州的四季青公司，总RNA 提取试剂盒和逆转录PCR 试剂盒均购于北京的天根公司，蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒和PCNA单克隆抗体购于武汉的博士德公司，雌二醇放射免疫分析试剂盒购于北京的中国北方生物技术公司。

1.2 主要仪器设备 双能X 线骨密度仪（Lunar，美国），超净工作台（长城空气净化设备工程，北京），酶联免疫检测仪（Bio-Tek，美国），CO2恒温孵箱（T-F，美国），倒置相差显微镜（Leica, 德国), 紫外分光光度计（BeckmanDU640，美国）,TDZS-WS 型多管架自动平衡高速离心机（湘仪公司，长沙），低温高速离心机（Eppendorf，德国），ST-Ⅰ型半干式转移电泳槽（竞迈生物，大连）。

1.3 动物来源20 只SD 大鼠购于中国人民解放军医学院，约12 周龄，重约300g，健康未孕雌性。在动物中心先行喂养7d，然后进行分组实验。

1.4 动物模型建立方法 骨质疏松大鼠模型的建立在前期实验中已经有所报道［10］。实验经过动物实验伦理委员会批准同意（批件号：2016 科研伦理审第29 号）。动物被随机分成两组：去势组（10只）及假手术组（10 只)，去势组的大鼠在麻醉下腹部入口摘除双侧卵巢；假手术组的大鼠在麻醉下腹部入口摘除卵巢附近的与卵巢约同等大小的脂肪组织。术后肌肉注射青霉素预防伤口感染，发现两组大鼠均可正常活动和饮食，伤口未出现明显感染，无动物死亡情况发生。术后正常喂养12 周后，大鼠于麻醉下行腰椎和股骨的骨密度检测（双能X线骨密度仪）。同时抽取大鼠视网膜动脉血，离心10min，取上层血清使用雌二醇放射免疫分析试剂盒测定血清中雌二醇水平。用于评估骨质疏松大鼠模型是否成功建立。

1.5 成骨细胞获取和培养 全麻下处死骨质疏松大鼠, 无菌条件下取出下颌骨，将下颌骨浸泡和冲洗后，去除肌肉和筋膜，拔除牙齿，用酶消法和组织块法联合培养［10］。首先，洁净操作台上，操作者戴无菌手套用无菌剪刀将下颌骨逐步剪成小块，约2mm×2mm 的大小，在PBS液体中浸泡冲洗3次收集骨片。然后用0.125%胰蛋白酶反复孵育消化骨片6次，每次8min，除首次酶消化的液体丢弃外，后5次消化的液体收集到一起，并于高速离心机上离心，上层液体丢弃，下层的细胞加入培养基并且混匀后接种于培养瓶中。经过酶反复消化后的小骨片，直接加入含20%胎牛血清的培养基，在器皿中进一步剪成更加细小的微型骨片，平铺于培养瓶中培养。3d后更换新的培养基，等待全瓶培养出细胞后进行细胞传代。

1.6 成骨细胞分组干预 将第三代成骨细胞接种于6个6孔板（2×105细胞/孔）和6个25cm2的培养瓶中（5×105细胞/瓶）, 用不含血清的培养基同步化培养细胞1d，然后将细胞分成两组，依普黄酮组和对照组。依普黄酮组（IP group)：加入含药物完全培养基（将依普黄酮用完全培养基稀释，获得实验所需要的依普黄酮浓度10-8M。）；对照组（control group)：不含药物完全培养基。6孔板中每个孔2ml, 培养瓶每瓶5ml。继续培养72h。分别进行逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）实验。

1.7 成 骨 细 胞ERα、ERβ 和PCNA 的RT-PCR 去除培养基后，用PBS 洗涤成骨细胞3次。首先用Trizol（北京天根生物科技公司，中国）冲洗细胞板，获得RNA。 然后使用Quantscript-RT 试剂盒（北京天根生物科技公司，中国）直接反转录1.5μg 的mRNA，用来制备cDNA，并进行PCR。所使用的引物情况如下，ERα（221bp，F: TTTGCTCCTAACTTGCTCTTGG，R: GGAGACGTGAGACGAGTCCAT），ERβ（412bp，F: GATGGAGGTGCTAATGGTGG，R:GCCCTTGTTACTGATGTGCC），PCNA（135bp，F：TTTGAGGCACGCCTGATCC，R：GGAGACGTGAGACGAGTCCAT），GAPDH（349bp，F:GAAATCGTGCGTGACATTA，R:TAGGAGCCAGGGCAGTAA）。每个25μl 的PCR 反应体系包括cDNA模板1.5μl，dNTPs（10mM）0.5μl，10×PCR 缓 冲液2.5μl，β-肌动 蛋 白f（25pmol/ul）0.5μl，Taq 酶（2u/ul）0.5μl 和ddH2O。首先在94℃预变性2min 和初始变性30s，接着分别在63℃退火30s 和在72℃延伸30s，总共30个循环。循环结束后，采用琼脂糖凝胶对PCR 产物进行电泳，采集图像，用图像采集分析软件（PerkinElmer，Waltham，Massachusetts，USA）对各条带积分光光密度（IOD）进行分析，目的基因的表达水平采用目的基因与GADPH基因的IOD值之比来表示。

1.8 统计分析 采用SPSS 22.0 软件，数据结果用平均值±标准差表示。两组之间的比较采用t检验的方法进行分析，如果P<0.05 则认为该差异有统计学意义。

2.结果

2.1 骨质疏松大鼠动物模型的建立 术后12周时，比较了去势组和对照组大鼠的骨密度和血清雌二醇水平，发现去势组大鼠腰椎的骨密度、股骨的骨密度和血清雌二醇水平在术后12 周与假手术组相比显著降低（P<0.05），见表1，骨质疏松大鼠模型成功建立。

表1 大鼠术后12周时腰椎骨密度、股骨骨密度和血清雌二醇水平检测

2.2 骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞 酶消化后的成骨细胞贴壁生长较快，约4h 后，组织块培养的成骨细胞在第3d 时，才能观察到少量的成骨细胞从组织块中爬出。细胞一开始时呈现三角形或短梭形，生长几天后细胞的形态开始多样化，呈现出多边形、方圆形和多角形等。等待细胞铺满全瓶后传代，进行下一步的实验（见图1）。

图1 骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞（×200）

2.3 PCNA、ERα 和ERβ 的mRNA 在依普黄酮干预骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞后的表达情况

用含10-8M依普黄酮的培养基干预培养骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞后，见图2，发现与对照组相比，依普黄酮组PCNA的mRNA表达量明显升高（对照组0.29±0.08，依普黄酮组0.69±0.11，P<0.01），ERα 的mRNA表达量明显降低（对照组0.74±0.09，依普黄酮组0.61±0.06，P<0.05），ERβ的mRNA 的表达量明显升高（依普黄酮组1.09±0.09，对照组0.85±0.12，P<0.05)。并且这种差别有统计学意义。

图2 依普黄酮对PCNA、ERα和ERβ的mRNA表达的影响（＊P<0.05，＊＊P<0.01）

3.讨论

骨质疏松作为一种多发病，雌激素常常作为骨质疏松治疗药物应用广泛，但是雌激素对子宫和乳腺等的副作用较大，使得患者和医师对于它的使用又心有余悸。依普黄酮作为一种植物雌激素，结构与雌激素类似，但是它既有类似于雌激素的治疗骨质疏松的作用，而对某些靶器官如子宫和乳腺等却没有雌激素的副作用，使得在很多国家得到了广泛应用，所以很有希望成为骨质疏松理想的治疗药物。对于依普黄酮对骨组织相关细胞的研究，陈丽诊等曾在诱导的兔破骨细胞模型研究中发现，依普黄酮对破骨细胞有抑制作用，并且10-8M 的依普黄酮抑制作用最好［11］。在前期的研究中我们也发现10-8M 的依普黄酮对骨质疏松颌骨成骨细胞的增殖分化能力上作用最大［12］。所以在本实验中，我们采用了10-8M 的依普黄酮干预浓度，并且也确实发现该浓度的依普黄酮对骨质疏松颌骨成骨细胞在ER和PCNA 的表达上均有一定的影响，从而可能为依普黄酮在口腔领域中的应用进一步提供了一定的实验研究基础。

在研究骨质疏松症的发病机制中，雌激素受体一直受到广泛的关注，许多药物正是通过直接或间接影响雌激素受体而发挥作用。雌激素受体有两种（ERα 和ERβ），ERα 发现和克隆较早，在20世纪60年代被发现并于1986年被克隆［13，14］，ERβ在1996年才被鉴定和克隆［15］。ERα 和ERβ 在C端配体结合区和N 端反式激活区不同，其所起的作用当然也会有所不同。并且有学者报道ERα 主要在皮质骨中表达，而ERβ 在松质骨中表达水平较高［16］。与ERα 相比，ERβ 在体外成骨细胞培养中始终高表达，提示在雌激素作用机制中起着重要的作用［17］。本实验结果表明，依普黄酮通过促进ERβ 和抑制ERα 对成骨细胞产生作用。作为包含牙齿的颌骨，其牙根大部分均包绕在松质骨内，并且种植后的种植体也大部分位于松质骨内，所以，如果ERβ 的表达能增强，就可能会改善松质骨的骨代谢，从而在骨质疏松症颌骨的治疗过程中发挥重要的作用。同时有研究表明ERα 和ERβ 互补，两者可能为阴阳关系，ERβ 通过抑制ERa介导的基因转录，部分替代ERα 的功能［18,19］，从而可能也会影响和改善皮质骨的骨量。另一方面，在子宫内，在子宫内膜增殖中起主导作用的是ERα，在抗细胞增殖中起作用的是ERβ，所以如果依普黄酮降低ERα 表达和增加ERβ 表达适用于子宫，就会起到降低子宫内膜过度增殖的作用，但是，这种推测是否成立，尚需进一步的实验研究。

本实验结果还提示依普黄酮可以促进PCNA的mRNA 的表达。而PCNA 是仅在增殖细胞胞核中合成与表达的，是反映细胞增殖状态的指标，其表达的高低与细胞增殖密切相关［20］。在肿瘤的临床及实验研究中，PCNA 的检测被广泛应用，但是近几年来，PCNA 在骨组织或成骨细胞中的研究也日渐增多。有研究表明PCNA 的激活可以抑制成骨细胞的凋亡，促进骨折的愈合［21］。并且有学者通过检测成骨细胞PCNA的表达情况，来作为初步判断药物对骨质疏松症的防治效果或者骨形成情况的参考指标［22,23］。也有学者研究发现PCNA 表达强弱与骨纤维结构不良病变的复发与否密切相关，它可以作为骨纤预后估测的一个重要参考指标［24］。所以本实验中的PCNA 也许可以作为评测骨质疏松大鼠颌骨成骨细胞的增殖状态的一种参考指标，并且依普黄酮促进其表达也可以提示依普黄酮可以促进骨质疏松颌骨成骨细胞的增殖。

总之，本实验结果提示依普黄酮可以促进骨质疏松颌骨成骨细胞的ERβ 和PCNA 的表达，但是减少ERα 的表达。当然，还有很多的研究需要继续深入进行，从而探究骨质疏松颌骨的分子机理，找到防治颌骨骨质疏松更好的药物。