基于高通量芯片对小儿流感生物信息学分析

金 虹，李晓岚

(泰康同济(武汉)医院 儿科, 湖北 武汉 430050)

急性呼吸道感染是儿童最常见的疾病，流感病毒是常见病原之一。学龄前儿童流感病毒感染率较高。通常认为流感是一种轻微的疾病，但是在有潜在慢性疾病的儿童中，可能会导致较高的病死率。众所周知，流感病毒可引起季节性暴发、流行和大流行。20世纪曾有4次流感大流行，据报道，1918年第一次流行的H1N1流感病毒感染了全世界5亿人，导致5 000万至1亿人死亡，占世界人口的3%～5%。2009年的猪源性H1N1毒株也造成全球约17 000人死亡[1]。流感病毒属于正黏病毒科的RNA病毒，有3种类型(A型、B型和C型)，分段的病毒基因组被包裹在一个含脂质的表面包膜中，其表面有2种主要的表面抗原：血凝素(hemagglutinin, H)和神经氨酸酶(neuraminidase, N)。流感病毒的亚型是由这些H和N抗原决定的。A型病毒有许多亚型，它们具有不同的H和N抗原组合(例如H1N1、H3N2、H5N1), B型和C型病毒没有已知的亚型[2]。A型病毒能感染多种物种(人、禽、猪、马)，且其抗原不稳定，已知可在病毒基因组内发生突变(抗原转移)，人群对此没有免疫力，尤其是婴幼儿，每一次的流感病毒株都属于新抗原，且很容易在人与人之间传播，造成疾病爆发和大流行。小儿是流感病毒的易感人群，6个月以下小儿因为母乳的被动免疫而较少感染本病，6个月至3岁儿童是流感病毒感染的高危人群，重症流感占比较高。年长儿童感染流感病毒与成人相似，主要临床表现为急性发热、寒战、流鼻涕、咳嗽、咽喉痛、头痛和肌痛，重症患者可继发中耳炎、鼻窦炎、败血症、心肌炎和脑炎等，而婴幼儿流感症状不典型[3]。当前对流感的诊断主要依靠病史、临床症状及相关流行病学资料，而病毒核酸及抗体的检查又往往滞后，即便对于一个经验丰富的临床医生来说，对伴有发热的呼吸道疾病患儿做出病因诊断仍是非常困难的。因此，我们需要进一步了解流感病毒的发病机制和机体对应的生物学改变，筛选出可能的临床标志物，为早期临床诊断及防控决策提供新的参考标准。基于生物信息学的发展和高通量测序技术的进步，本研究利用现有的基因芯片数据库对流感患者和正常人的差异基因(differential gene, DEG)进行分析，阐述新的发病机制，为临床的诊疗和疾病预防提供新的依据及方法。

1 资料与方法

1.1基因芯片数据的获取 以“influenza”，“children”，“pediatrics”为关键检索词，在基因表达数据库(gene expression database, GEO)搜索儿童流感病毒感染相关数据库。最终共检索到相关的GSE42026，GSE29366，GSE34205，GSE38900等4个芯片数据库。

1.2DEG的筛选 通过基因分析表达工具(GEO2R)对正常患者和流感病毒感染患者外周血DEG进行筛选，筛选条件：P<0.05且LogFC>1或LogFC<-1。对DEG绘制火山图，同时绘制韦恩图对DEG进行取交集分析。

1.3DEG的功能富集分析 对所有的DEG进行大规模的基因本体(gene ontology, GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析，分析DEG所富集的相关信号通路。GO分析主要包括细胞成分、分子功能以及生物过程。

1.4DEG的蛋白互作分析 将DEG输入String 12.0在线网站进行蛋白互作网络分析。然后，将蛋白网络互作数据库导入Cytoscape进行数据分析，采用Cyto-Hubba插件分析蛋白质相互作用网络关联度，筛选出枢纽基因。

2 结 果

2.1DEG筛选 GSE42026数据库上调基因344个，下调基因418个，GSE29366数据库上调59个，下调312个，GSE34025数据库上调37个，下调93个，GSE38900数据库上调47个，下调276个。对所有DEG进行汇总分析，发现共同上调基因1个，共同下调基因29个，见表1～2，图1～2。

图1 DEG筛选分析

表1 4组数据库一般情况

表2 DEG的基因筛选情况

2.2GO和KEGG富集分析 对DEG进行GO分析发现，在生物学过程方面主要富集在Ⅰ型干扰素信号通路，细胞对Ⅰ型干扰素的反应、病毒基因组负调控和干扰素-γ介导信号通路，见图3，表3。分子功能主要包括2′-5′-寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′-oligoadenylate synthase, OAS)活性、双链RNA结合物、转移酶以及核苷酸转移酶活性，细胞成分主要包括线粒体、细胞外间隙、胞外区、溶酶体及细胞质，见图4。KEGG分析主要富集在甲型流感、麻疹、单纯疱疹病毒感染、丙型肝炎信号通路，见表4，图5。

表3 儿童流感患者DEG的GO富集分析

表4 儿童流感患者DEG的KEGG通路分析

图2 DEG基因筛选过程

图3 DEG的GO富集分析

图4 DEG的GO分析：BP-生物学过程、CC-细胞组分和MF-分子功能

图5 儿童流感患者DEG的KEGG通路分析

2.3蛋白互作网络图 通过STRING数据库对儿童流感发病的DEG构建PPI网络，见图6。应用 Cytoscape 将蛋白网络可视化，Cyto-Hubba 插件根据节点数筛选出前10个枢纽基因，分别是：IFIT3、MX1、OAS3、OAS2、OAS1、IFI27、IFI44、RSAD2、IFI44L、LY6E，颜色越深代表节点数越多，见图7。

图6 靶基因PPI网络关系

图7 前10枢纽基因关系

3 讨 论

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病，可在全世界范围内暴发和流行。在儿童中，流感是导致急性呼吸道疾病最常见原因之一。其主要是通过受感染者的飞沫或直接与人或寄生虫接触传播流感病毒，临床表现与其他病毒导致的呼吸性疾病的临床症状相似，包括急性发热、发冷、流鼻涕、咳嗽、疥疮、头痛和肌痛。目前临床主要依靠病毒培养、鼻咽拭子RT-PCR或血液中的特异性中和抗体来完成确诊，且其阳性率低，往往需要患者住院几天后才能进行确诊，缺乏早期特异性诊断标志物。同时患儿感染流感病毒可从轻微表现发展到重症流感和急性呼吸窘迫综合征，呼吸衰竭甚至死亡[4]。当前对流感病毒感染患儿的治疗主要是以广谱抗病毒为中心的支持治疗，缺乏高效特异性窄谱药物，且随着病毒不断突变，耐药株也不断增加，因此进一步明确流感病毒感染机制，更好地理解病毒与宿主的相互作用，筛选出流感病毒感染的标志物至关重要。

基于高通量生物信息学技术，本研究利用GEO，对流感患者和正常健康儿童外周血总RNA表达谱数据进行分析，通过对4个数据库相同基因取交集进行分析发现差异表达的基因30个，其中上调基因1个，下调基因29个。通过对DEG进行富集分析发现，流感患儿细胞对干扰素的反应、病毒基因组负调控和干扰素-γ介导信号通路发生明显改变。干扰素是体内重要抗病毒因子，当流感病毒进入细胞时，病原体识别受体(pathogen recognition receptors, PRRs)检测病毒RNA(vRNA)，并启动干扰素基因的转录。干扰素转录后，介导干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表达或通过旁分泌时在邻近非感染细胞中的表达[5]。ISGs可以阻止病毒包膜和内质体膜之间的融合，促进蛋白降解，抑制流感病毒的转录和翻译，激活细胞抗病毒基因表达。线粒体作为哺乳动物天然抗病毒信号转导的平台，通过线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)和MAVS的激活改变线粒体形态。线粒体动力学、物理性质以及由此引起的MAVS分布和聚集的变化在调节先天免疫反应中起着重要作用[6]。线粒体伸长和融合促进MAVS聚集成活性复合体，而线粒体的分裂和裂变削弱了维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)样受体(retinoic acid-inducible gene I [RIG-I]-like receptors，RLR)信号通路[7]。研究发现甲型流感病毒M2蛋白与MAVS共定位并相互作用，正调控MAVS介导的先天免疫，促进线粒体融合，增加线粒体数量。进一步的研究表明，M2蛋白诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生是激活巨自噬/自噬和增强MAVS信号通路所必需。重要的是，M2蛋白的质子通道活性是ROS产生和拮抗自噬途径以控制MAVS聚集所必需，从而增强MAVS信号活性[8]。KEGG分析主要富集在甲型流感、麻疹、单纯疱疹病毒感染、丙型肝炎信号通路，提示流感病毒和其他病毒存在相似的感染途径。

干扰素是一类细胞因子，在机体固有免疫和调节性免疫过程中有重要作用，主要是通过调节Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)信号通路并促进ISGs的表达来实现，其中三角形四肽重复蛋白(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats, IFIT)是ISGs中最有效的蛋白之一。IFIT3又叫维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced G, Rig-G)，最初是在维甲酸处理急性早幼粒白血病细胞的时候被发现的。除了维甲酸之外，IFIT3还能在各种造血细胞或者实体瘤细胞中被干扰素诱导表达，例如头颈癌细胞、肺小细胞癌细胞、宫颈癌细胞以及上皮样的WISH细胞[9]。研究发现干扰素治疗导致乙型肝炎患者IFIT3明显升高，而肝细胞的病毒感染也导致干扰素非依赖性IFIT3的直接上调。某些ISGs在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的相反作用，提示IFIT3可能是治疗HBV感染的一个新靶点。并且IFIT3的表达是接受干扰素治疗患者预后的重要标志，IFIT3高表达与患者的预后相关[10]。动物研究中猪四肽重复序列3干扰素诱导蛋白(porcine interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3, poIFIT3)是干扰素-α/β和猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)最易诱导的基因之一。感染SIV的猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAM)中poIFIT3上调，过度表达能有效抑制SIV的复制，而poIFIT3的抑制作用增加了SIV的复制。进一步的实验表明，poIFIT3的C端在其抗病毒活性中起主要作用。此外，poIFIT3可通过IRF3和NF-κB介导的信号通路显著增强干扰素-β启动子活性, 通过靶向MAVS增强干扰素-β的产生[11]。

Mx基因是Lindenmann[12]研究A2G小鼠对流感病毒具有天然抵抗力这一现象时发现的，能抵抗黏液病毒而命名为Mx基因。Mx基因的表达受Ⅰ型干扰素介导(干扰素α/β)调节。Mx属于GTPase动力蛋白超家族成员，具有GTPase活性，内在GTP酶活性是其抗病毒活性所必需的。Mx蛋白在大多数脊椎动物中高度保守，人MxA与小鼠Mx1具有约67%的氨基酸序列同源性。大约50年前，干扰素诱导的Mx1基因在小鼠体内, 是流感病毒的有效限制因子。携带功能性Mx1基因组的小鼠对甲型流感病毒感染具有抵抗力。由于Mx1是病毒复制的重要细胞内调节因子，Mx1缺乏会增加小鼠对流感感染的易感性。Mx蛋白的亚细胞定位影响其抗病毒活性。啮齿动物Mx1位于细胞核中并限制病毒复制，而人类Mx位于细胞质中并通过阻止病毒RNA的导入来限制病毒复制，这种蛋白的缺乏增强了对流感病毒的易感性[13]。且研究发现人类Mx对Thogoto病毒、水泡性口炎病毒等多种病毒发挥抑制作用，本研究发现流感患儿体内Mx1表达降低，因此，Mx1可能是抗流感治疗的另一个有效靶点。

OAS是受干扰素诱导的蛋白家族，属于保守双链RNA结合分子家族，其N端能够结合dsRNA结合域。在机体正常情况下，OAS静止在细胞中以低水平存在，在干扰素作用时能被强烈诱导。核糖核酸酶L是一种在感染过程中被激活的抗病毒酶，能降解病毒和细胞内的核糖核酸酶，抑制蛋白质合成，限制多种病毒的复制和传播[14]。在人类中，有4个OAS基因是由干扰素刺激产生的，但其中只有3个编码有催化活性的蛋白质。OAS1、OAS2和OAS3分别包含1个、2个和3个核心OAS单元，但这3种酶在与dsRNA结合时都从ATP合成2′-5′-寡聚腺苷酸(2′-5′-oligoadenylate，2-5A)。2-5A唯一确定的功能是激活核糖核酸酶L，引起病毒和细胞ssRNAs的内切核裂解，从而阻断病毒复制，但在完整细胞中，OAS3对dsRNA的亲和力高于OAS1或OAS2，这与它在核糖核酸酶L激活中的主导作用相一致[15]。

在OAS基因家族中，干扰素可以显著诱导OAS2高表达。在细菌感染过程中，OAS2增强RNA水解酶L活性，诱导先天免疫的活化[16]。病毒感染患者和干扰素治疗后OAS2的表达水平升高[17]。此外，发现OAS2可抑制日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)和其他病理性分子模式识别受体(pathogen-associated molecular patterns recognition receptors PRRSV)相关病毒的复制，寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)感染诱导OAS2表达，OAS2通过干扰素激活的JAK/STAT信号通路发挥抗ZIKV活性[18]。OASl基因单核苷酸多态性(SNP)与一些病毒感染性疾病易感性之间存在相关性，如SARS病毒、西尼罗河病毒、肠道病毒等。另外干扰素诱导蛋白27(interferon-induced-protein 27, IFI27)、干扰素诱导蛋白44 (interferon-induced protein 44, IFI44)、以及干扰素诱导蛋白44样蛋白(interferon-induced-protein 44-like, IFI44L)均为干扰素诱导相关蛋白，参与病毒感染后免疫反应，且研究报道IFI27可以作为鉴别流感病毒感染和细菌感染的标志物，其特异度高达90%[19]。

综上所述，流感病毒感染导致机体发生以干扰素为中心的一系列信号通路改变可能是小儿流感的主要发病机制，有可能为临床提供新的治疗靶点。