基于2b-RAD简化基因组测序的三门湾海域3种优势鱼类群体遗传多样性分析

王星火，常雪晴，程方平，马路阔，徐旭丹，王有基，黄 伟

（1.自然资源部第二海洋研究所，自然资源部海洋生态系统动力学重点实验室，浙江杭州 310012；2.上海海洋大学，国家海洋生物科学国际联合研究中心，上海 201306；3.上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

三门湾位于中国浙江省东部，总面积约775 km2，海岸线总长度304 km，北邻象山港，南接浦坝港，湾口面向东南，湾内岛礁罗列、水道纵横，是一座近海天然避风良港［1］。三门湾地处亚热带季风气候区，温暖湿润，生物饵料资源丰富，有利于鱼类产卵和索饵［2］。近年来，随着三门湾海域及周边地区人类活动加剧，城镇化和工业化进程加快，涉海工程和养殖活动增多，对生物群落和水域环境产生一定影响，三门湾渔业资源已呈现出明显的衰退趋势［3－4］。因此，亟需对其生物遗传多样性现状及其未来可能对野生鱼类群体产生的遗传学影响展开针对性科学评价。

遗传多样性（genetic diversity）是生命进化和物种分化的基础，是物种多样性和生态系统多样性的基础，也是评价自然生物资源的重要依据［5］。海洋动物种群遗传多样性研究具有重要的理论和实际意义，可为评估资源现状、野生群体保护、养殖群体种质遗传改良、海洋生态环境修复等工作提供依据［5－6］。近年来，随着简化基因组测序技术等新手段不断发展，有效促进了水产生物资源遗传多样性研究水平［7－8］。其中，简化基因组测序（2b-RAD）技术已逐步成为单核苷酸多态性（SNP）开发最为有效的手段之一，并高效应用于非模式生物尤其是水生生物［9］。该技术主要利用IIB型限制性内切酶，可快速进行全基因组范围高通量SNP筛查和分析［10］。该技术可获更多的标记数目，具有更高的分型准确率，可很好地应用于群体遗传多样性分析领域［10］。

本研究对三门湾海域生态功能较为重要的3种鱼类优势种进行采集。通过对鱼类群体结构和遗传多样性进行生物信息分析，评估了三门湾海域渔业资源现状，以期为海洋生态保护与修复、鱼类资源利用与保护等提供理论支撑和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究于2019年11月（秋季）、2020年2月（冬季）和5月（春季）进行，在三门湾选取20个调查站位，采用渔业资源底拖网开展样品采集，具体站位布设详见图1。从获取的渔获物中挑出白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼和龙头鱼样本冷冻保存，运送至实验室备用。

图1 三门湾渔业资源调查站位图Fig.1 Sampling sites of fishery survey in the Sanmen Bay

1.2 DNA提取与检测

加入10μL蛋白酶K（20 mg·mL－1），在56℃条件下消化，加苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）进行抽提，然后加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀［11］。抽提出的DNA进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 2b-RAD文库构建和测序质量分析

采用2b-RAD五标签串联技术构建3种鱼类群体的测序文库［12］。所有样品采用标准型接头（BsaXI酶采用5′-NNN-3′接头）与酶切标签连接，通过Illumina Hiseq X ten系统进行双端测序（Paired-end）。得到的原始图像数据文件经碱基识别转化成原始测序序列，将拼接好的测序序列进行过滤以保证数据分析结果准确性。根据建库时各样品位置提取对应序列，过滤删除不含酶切识别位点的序列，最后得到各样品的高质量测序序列。

1.4 SNP分型

利用SOAP软件（version 2.21）进行测序数据比对［13］，利用最大似然法（ML）进行位点分型［14］。分型工作完成后对分型结果进一步过滤以保证后续分析的准确性。

1.5 数据处理

SNP位点的分型结果处理使用Genepop软件（Version 1.0.5）［15］。计算物种有效等位基因数（Ne）、期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）、多态信息含量（PIC）等遗传参数。用vcftools软件（Version 0.1.14）计算核苷酸多样性（Pi）和转换／颠换（Ts／Tv）的比值［16］。使 用plink（Version 1.9）软件计算1-IBS矩阵（遗传距离）［17］，vcftools软件计算哈温平衡P值［18］。将每个群体内个体SNP标记首尾相连，若缺失相应位点，用“－”替代。

2 结果及分析

基于DNA序列变异的群体遗传参数分析是衡量群体遗传结构的主要指标。白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼、龙头鱼群体遗传多样性参数统计结果见表1。

表1 三门湾海域3种优势鱼类群体遗传多样性参数Tab.1 Genetic diversity parameters of three dominant fish populations in the Sanmen Bay

2.1 SNP分型结果及突变类型特点

本研究利用2b-RAD简化基因组测序技术，分析白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼和龙头鱼3种鱼类群体的遗传多样性参数。发现3种鱼类种群均存在较多的SNP位点，其中白姑鱼SNP最多（125 225），其余2种鱼类SNP位点数量相近，分别是龙头鱼（55 128）、中华栉孔虾虎鱼（51 283）。3种鱼类种群之间SNP数量存在差异，表明在人类活动、环境因素和物种进化历史等因素影响下，不同的突变位点和发生频率形成了种群的进化特点［19］。

2.2 遗传平衡

通过哈温平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）检验群体中等位基因频率及基因型频率之间的关系。3种鱼类群体哈温平衡P值均大于0.05，表明其均达到了遗传平衡。其中，白姑鱼群体哈温平衡P值为0.28，中华栉孔虾虎鱼群体为0.80，龙头鱼群体为0.68。

2.3 杂合度

分别统计3种鱼类群体期望杂合度（He）和观测杂合度（Ho）。结果显示，白姑鱼观测杂合度（0.055）＜期望杂合度（0.244），显示出群体内纯合子较多，杂合子缺失；而中华栉孔虾虎鱼观测杂合度（0.230）＞期望杂合度（0.210），龙头鱼观测杂合度（0.302）＞期望杂合度（0.271），显示出杂合过度。群体的杂合度能够较准确反映群体遗传多样性，观测杂合度高一般情况下表明群体遗传多样性较丰富，研究中3个鱼类群体以龙头鱼观测杂合度最高（0.302），表明龙头鱼相较于其他两种鱼类群体遗传多样性更丰富。

2.4 多态信息含量

分别统计3种鱼类群体的多态信息含量，对等位基因多态性进行估计，作为衡量DNA变异程度高低的一个指标。多态信息含量显示，白姑鱼（0.208）、中华栉孔虾虎鱼（0.177）和龙头鱼（0.221）均为低度多态（PIC＜0.25），其中龙头鱼相对于其他2种鱼较高。

2.5 有效等位基因数

有效等位基因数可在一定程度上反映群体的变异程度。结果显示，龙头鱼观测等位基因数（1.448）最接近有效等位基因数（2），白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼次之，表明等位基因在群体中分布均匀程度为龙头鱼＞白姑鱼＞中华栉孔虾虎鱼。

2.6 核苷酸多样性

核苷酸多样性常用于衡量群体内或群体间的多样性，是遗传变异的一个量化值。核苷酸多样性指标中，龙头鱼（0.281）＞白姑鱼（0.259）＞中华栉孔虾虎鱼（0.219），表明3种鱼类群体中，龙头鱼序列间多样性最大，白姑鱼次之，中华栉孔虾虎鱼最低。

3 讨论

简化基因组测序技术具有获得的标记数目更多、分型准确率更高等优势，已有多个研究将这种方法应用于多个物种的遗传多样性研究［7，10，20］。本研究利用该技术分析评价了三门湾3种鱼类种群遗传多样性水平。SNP碱基替换类型可分成转换（Ts）与颠换（Tv）两类，理论上转换／颠换（Ts／Tv）为0.5，但实际上往往会发生“转换性偏差”，即转换／颠换（Ts／Tv）大于1.5［21］。由于不同物种间Ts／Tv存在很大差距，通过对SNP位点特征的分析发现，本研究3种鱼类群体的变异位点比例均处于较低水平，转换／颠换（Ts／Tv）均大于1.5，表明三门湾海域鱼类的SNP多态性类型与大多数脊椎动物相似，存在明显的转换型偏差现象［22］。本研究中龙头鱼的Ts／Tv为1.61，而白姑鱼则达到2.16，这可能与不同物种在进化中承受的选择压力不同有关［23］。

物种遗传多样性是在长期进化中产生的，也是物种生存发展的基础［24］。遗传多样性可在一定程度上反映环境生物丰富度及演替趋势。种群进化和历史因素是遗传多样性水平降低的主要原因，地理隔离和近亲繁殖会导致群体间基因交流困难，基因丰富度降低，单一化现象严重［25］。本研究3种鱼类群体变异位点比例、等位基因多态性等遗传多样性参数均较低，表明该水域3种定居性优势鱼类群体遗传多样性水平均较低，并且同种群个体间的遗传分化较小，遗传结构较稳定。推测其原因之一可能是与鱼群低龄现象明显、群体年龄组成简单有关。研究发现，真鲷（Pagrusmajor）相较于其他鱼类具更高比例多态位点和遗传变异度，可能是由于真鲷具有较长的生命周期、更复杂的野生群体年龄组成，这两种特质更有利于自然选择，并可在一定程度上避免近亲繁殖和瓶颈效应［26］。近年来，三门湾近岸海域持续呈现富营养化状态、水体污染严重，在一定程度上造成了生态系统退化，加上人类捕捞、养殖活动对生态系统的干扰，导致鱼类小型化、低龄化、低值化现象愈发突出［3，31－32］。2014年对三门湾游泳动物进行的调查发现，该海域游泳动物资源密度和丰富度与其他海湾相比均处于较低水平，且春季鱼类的幼体比例高达93.99%［3］。本研究同样发现，三门湾鱼类幼体比例处于较高水平（70.97%）。

本研究中白姑鱼隶属鲈形目（Perciformes），石首鱼科（Sciaenidae），白姑鱼属，为暖温性近底层鱼类，有明显季节洄游习性，春季因生殖集群游向近岸产卵场，一般栖息于水深40～100 m泥沙底海区，为捕食性鱼类，食性较杂，主要摄食底栖动物及小型鱼类［27－28］。中华栉孔虾虎鱼隶属鲈形目（Perciformes），虾虎鱼科（Gobiidae），栉孔虾虎鱼属，为暖水性近岸底层小型鱼类，摄食浮游 生物［29］。龙头鱼隶属仙女鱼目（Aulopiformes），狗母鱼科（Synodontidae），龙头鱼属，为大陆架水域中下层鱼类，主要摄食鱼类和甲壳类［30］。根据3种鱼类遗传多样性结构比较分析结果，并比对既往于2007年12月（冬季）和2008年6月（夏季）［2］、2014年11月（秋季）和2015年5月（春季）［4］进行的三门湾渔业资源调查结果，发现与白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼相比，龙头鱼作为三门湾主要鱼类优势种的出现频率更高，推测这是由于相比于其他2种鱼类，龙头鱼种群遗传多样性相对更丰富。

基于上述分析，本研究中三门湾海域白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼和龙头鱼等3种优势鱼种遗传多样性水平较低，一旦受环境变化、人类捕捞等干扰，遗传多样性可能难以恢复，进一步造成鱼类种质资源衰退［6］。因此，未来需重点关注此海域生物群体遗传多样性水平较低的现状，及时加强种质资源的收集、保存，利用简化基因组或全基因组等多种分析技术进一步揭示基因遗传信息、生物遗传背景，分析气候变化与人类活动对生物的影响，进而制订更合理的保护与利用策略［6，33］。针对三门湾白姑鱼、中华栉孔虾虎鱼和龙头鱼等鱼类优势种，需注重加强其种质资源保护。

本研究中白姑鱼是3种鱼类中唯一的洄游性鱼类，东海沿海河口、海湾是白姑鱼的主要产卵场及索饵场。春季，白姑鱼在东海禁渔线以西水域产卵，并逐渐向北移动。夏季洄游至长江口海域和江苏南部近海。秋季随着冷空气南下，鱼群开始南下越冬洄游至长江口海域。冬季到达浙江中部和南部近海越冬场［34－35］。因此需要进一步采取措施加强对东海三门湾水域水生生物产卵场、索饵场、越冬场等栖息地的有效保护。海洋渔业资源作为一类再生资源是有条件的，离不开对鱼类资源的深入研究了解和科学管理，尽管近年来实施休渔制度和保护措施已取得一定成效，但从调查结果看，为加强生物遗传多样性保护，还需要进一步严格控制捕捞强度［34，36］，以促进渔业资源可持续利用。

致谢：本研究采样过程得到自然资源部第二海洋研究所朱根海、刘清河、武芳竹、于翔，浙江省海洋水产养殖研究所彭欣、陈伟峰等老师和同学的帮助，谨致谢忱！