基于浸泡法的鮻耳石锶标记技术研究

郭 彪，王 硕，张博伦，刘克奉，陈 卫，杨 健，姜 涛，曾祥茜，于 莹

（1.天津市水产研究所，天津 300457，2.天津市海洋牧场技术工程中心，天津 300457，3.中国水产科学研究员淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081）

鮻（Liza haematocheila）隶属鲻形目（Mugiliformes），鲻科（Mugilidae），鮻属，是亚洲地区鲻科鱼类中最主要的经济代表种，广泛分布与我国南海、东海、黄海和渤海。因鮻的食性为植食性或腐屑食性，主要摄食环境中的有机碎屑［1］，可起到净化养殖水域的作用，对维持水域生态平衡和优化环境具有重要作用［1］，因此鮻一直以来都是我国增殖放流的重要品种［2］。以天津市为例，2006—2018年，总计放流鮻7 347.302万尾，是所有海洋鱼类放流品种中数量最多的一个品种。全面、科学地分析评估放流取得的实际效果是保证工作有效开展的基础［3］，而放流个体标记和回捕率分析是目前放流效果评估的主要方法［4］。因此，近年来标记技术作为近海渔业生态修复领域的科学问题之一被广泛研究［5－7］。

目前，关于增殖放流鱼类标记的方法有挂牌标记、被动整合式雷达标、分子标记和耳石微化学标记等［8］。不同的标记方法有各自的特性和适用范围，要根据放流物种的实际情况进行选择［4］。国内鮻的增殖放流一般选择体长3～5 cm的苗种，放流数量较大、放流企业较多，且存在鱼苗遗传背景信息不清的问题。由于挂牌标记和被动整合式雷达标要求鱼苗体长较大且适合小规模标记［8－10］，而分子标记需要清晰的亲本遗传信息［11］，制约了标记技术在鮻增殖放流中的广泛应用，因此需要开发一种适合大规模放流小规格鮻的标记方法。

由于耳石是一种具有新陈代谢惰性的钙化结构［12］，沉积在耳石中的生境元素能永久性保存，可以很好地记录鱼类生境的变迁［13］。因此，一直以来耳石微化学分析作为一种重要技术手段，用于鱼类生境的重建和种群的鉴定［14－15］。随着学者们对大规模小规格鱼类标记方法的探索，耳石锶标记技术逐步由标记淡水鱼类［16］向标记海水鱼类［17］发展。与淡水及河口鱼类耳石Sr／Ca比值与生境中的Sr／Ca比值直接相关不同，海水中的Sr／Ca比值不是影响海水鱼类耳石Sr／Ca比值的主要因素［18］，海水鱼类耳石Sr／Ca比值可能受到海水环境中的Sr和Ca的相对浓度、鱼类种类特性、水温、盐度和鱼类生理状态等多种情况的影响［19］。因此，海水中锶浓度对海水鱼类耳石Sr／Ca比值的影响，需分种类进行区别研究。本研究拟比较不同浓度锶浸泡下，鮻的存活率和耳石标记效果，以探讨鮻耳石锶标记的可行性，为大规模鮻耳石锶标记放流提供基础数据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼的来源及暂养

实验用鱼为河北省黄骅市宏润水产养殖有限公司繁育的体长1 cm左右的幼鱼。幼鱼运回实验室后，在实验室驯化水系统中的3个600 L的立方养殖池中暂养一周。暂养期间，每天投喂配合饲料2～3次，日补水量约为10%，暂养海水为自然海水，盐度21～23、水温21～22℃、pH 7.83～8.03。

1.2 标记实验方法

实验开始前对海水中Sr2＋质量浓度进行测定，为7.9 mg·L－1。通过向海水中添加SrCl2·6H2O将海水中Sr2＋质量浓度分别提升至50、100、200、400 mg·L－1。其中，Sr2＋质量浓度400 mg·L－1的海水Sr2＋浓度处于过饱和状态，海水呈乳白色。

在50 L的实验水族箱中盛Sr2＋质量浓度分别为50、100、200、400 mg·L－1的海水，作为不同Sr2＋质量浓度标记组，分别用M50、M100、M200、M400代表50、100、200、400 mg·L－1试验组；同时，将无添加SrCl2·6H2O的自然海水单独注入一个50 L的实验水族箱，作为对照组，用C0表示。

挑选体长1 cm左右、健康的幼鱼500条，均匀分配到4个标记组和一个对照组，开始实验。每隔6 h观察一次各处理组中幼鱼的存活情况。整个标记期间不换水，每天正常投喂2～3次。标记48 h后，分别将每个处理组中的全部幼鱼单独转移到一个盛有自然海水600 L的立方养殖池（循环系统的一个养殖池）进行后期饲养。待幼鱼长至约10 cm左右时，每个处理组随机挑选5尾鱼进行耳石微化学分析。后期饲养期间，养殖用水和养殖管理同暂养，每天观察幼鱼的死亡状况，并做好记录。

1.3 耳石检测方法

1.3.1 耳石摘取及前处理

利用剪刀、尖头镊等工具将一对矢耳石取出，剔除有机质，分别用去离子水、无水乙醇清洗，置于48孔盒中干燥备用。从一对矢耳石中随机选取一块用于前处理和微化学分析，前处理参照李孟孟等［20］的方法，先将耳石用Epofix环氧树脂进行固定包埋，38℃烘干12 h以上。然后将包埋块用AB胶粘贴于干净的载玻片上，凝固2 h后，使用金刚石磨轮的碾磨机（Discoplan-TS型，Struers公司）切割碾磨。粗磨阶段用500目金刚砂轮碾磨至耳石微露，接着用1 200目砂纸精磨至耳石核心暴露，然后用磨抛机（Labo Pol-35，丹麦Struers公司）装备织布机抛光盘配合抛光液抛光，至耳石表面无明显划痕。最后将样品放入Milli-Q水中超声清洗5 min后，自然条件下晾干24 h，完全干燥后，使用真空镀膜机（JEE-420，日本电子株式会社）蒸镀碳膜（36A，25 s）。

1.3.2 耳石的EPMA分析

耳石的EPMA分析参考杨健和刘洪波［21］、司飞等［17］的方法，利用X射线电子探针微区分析仪（JXA-8100型EPMA，日本电子株式会社）从耳石核心沿耳石最长径至耳石边缘呈直线进行耳石锶元素定量线分析。标准样品使用碳酸钙（CaCO3）和钛酸锶（SrTiO3）。定量线分析（line transect analysis）EPMA的参数设定：加速电压为15 kV，电子束电流为2.0×10－8A；束斑直径为3μm，每点驻留时间15 s；以间距10μm连续进行打点测定。所有耳石线分析完后用电子束在耳石矢状面表面扫描进行面分析（mapping analysis）。其EPMA加速电压和电子束电流分别为15 kV和5.0×10－7A，束斑直径为3μm，像素为6μm×6μm，每点驻留时间为0.03 s。由于耳石中Sr含量远小于Ca含量，按照国际惯例将Sr／Ca比值标准化，即统一用Sr／Ca×103表示。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和Spss19.0软件对数据进行统计分析，采用单因素（one-way ANOVA）进行方差分析或χ2检验，利用Excel 2010和SigmaPlot 1.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 标记期间与标记后鮻存活情况

在标记期间，各处理组均未发生鮻死亡情况；标记后养殖期间，各处理组均有一定比例鮻死亡，经χ2检验，χ2值为0.984，P＞0.05；各处理组之间在标记期间和标记后养殖期间存活率均没有显著性差异。

2.2 不同标记浓度鮻耳石上锶元素的面分布

对50、100、200、400 mg·L－1浸泡组和对照组锶元素在耳石上沉积的面分布进行上机分析。4个标记浓度处理组的5个样本均出现明显的“高锶标记环”（图1）。

图1 不同锶浓度处理后鮻耳石锶元素面分布结果Fig.1 Sr concentrations of mapping analysis in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

2.3 不同标记浓度鮻耳石上锶元素线性分析

通过定量线分析可知，50、100、200、400 mg·L－1浸泡组的Sr／Ca比值均在距核200μm附近出现增高阶段（图2）。线性分析结果表明Sr2＋质量浓度50～400 mg·L－1，标记时长为48 h，鮻均被成功标记。

图2 不同处理组鮻耳石样品定量线分析结果Fig.2 Line transect analysis in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

将鮻耳石Sr／Ca比值的变化分成平稳阶段和显著变化阶段，并对其不同阶段的数值进行单因素方差分析，分析结果见表2。4个不同标记浓度组和对照组平稳阶段鮻耳石Sr／Ca比值未发现存在显著性差异（P＞0.05）。M50组和M100组鮻耳石Sr／Ca比值显著变化阶段的均值显著低于M200组和M400组（P＜0.05），M400组鮻耳石Sr／Ca比值显著变化阶段的均值显著高于其他3个标记组（P＜0.05）；Sr／Ca的峰值、Sr／Ca峰值为正常均值的倍数在不同处理组间的差异规律与Sr／Ca比值显著变化阶段的差异规律均值一致。4个不同标记浓度组鮻耳石形成的标记环宽度值也存在显著性差异（P＜0.05），其中M50组显著低于M200组和M400组（P＜0.05），但M100组、M200组和M400组3个处理组鮻耳石形成的标记环宽度没有显著性差异（P＞0.05）。鮻耳石Sr／Ca比值峰区均值为正常均值的倍数在4个不同标记浓度组存在显著性差异（P＜0.05），M400组显著高于其他标记组（P＜0.05），而M50组、M100组和M200组未发现显著性差异（P＞0.05）。

表2 不同处理组鮻耳石Sr／Ca比值变化Tab.2 Change of Sr／Ca ratio in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

对耳石Sr／Ca峰值、Sr／Ca显著变化阶段均值和标记环宽度分别与海水中Sr2＋浓度进行关系拟合，拟合结果见表3。从表3中可知，Sr／Ca峰值（即Ⅲ阶段Sr／Ca比）、Sr／Ca显著变化阶段均值（即Ⅱ阶段Sr／Ca比）与海水中Sr2＋浓度呈明显的线性关系，其拟合方程的R2值分别为0.999和0.987，而标记环宽度分别与海水中锶离子浓度拟合的线性方程R2值为0.824，但其拟合的对数方程R2值为0.967。

表1 标记期间与标记后鮻的存活情况Tab.1 Survival situation of L.haematocheila during marking or after marking

表3 耳石Sr／Ca参数指标与标记海水Sr 2＋浓度拟合结果Tab.3 Correlation of Sr／Ca parameter index of otoliths and Sr 2＋concentration of seawater used in marking

3 讨论

标志性放流是科学区分放流群体和自然群体、准确评估增殖放流效果的基础［22］。由于鮻放流个体较小和遗传背景不清晰，采用挂牌标记、被动整合式雷达标、分子标记等标记方法进行鮻的标记性放流，效果不是十分理想。耳石微化学标记作为一种小规格鱼类大规模标记的理想手段，已经在大黄鱼（Larimichthyscrocea）［22］、牙鲆（Paralichthysolivaceus）［17］等海水鱼中得以验证。本研究中4个标记浓度处理组鮻耳石均出现明显的“高锶标记环”的结果，说明采用耳石锶标记技术对小规格鮻进行标记是可行。在整个标记实验中，即使是海水Sr2＋浓度处于过饱和状态的情况下，48 h内鮻也没有出现死亡情况，标记后的58 d养殖期间，标记组鮻的存活率也与对照组基本一致。这与王臣等［23］、李秀启等［16］、司飞等［17］和张翼等［24］报道的外源Sr浓度对大麻哈鱼（Oncorhynchusketa）、鳙（Aristichthysnobilis）、牙鲆和黑鲷（Sparusmacrocephalus）幼鱼未产生任何影响的结果一致。综上，将耳石锶标记技术作为鮻小规格苗种大规模标记的方法是可行的、安全的。

本实验中Sr／Ca峰值、Sr／Ca比值显著变化阶段的均值和标记环的宽度均随着标记海水中Sr2＋浓度的增加逐渐增高，但3个参数指标与海水中Sr2＋浓度进行关系拟合结果却有所不同。其中Sr／Ca峰值和Sr／Ca比值显著变化阶段的均值与海水中Sr2＋浓度的关系为线性关系，拟合结果说明鮻耳石中的Sr／Ca比值与水体中的Sr／Ca比值呈正相关关系，这与司飞等［17］对牙鲆的研究结果一致。而标记环宽度与海水中Sr2＋浓度拟合的线性方程R2值为0.824，但其拟合的对数方程R2值为0.967，这表明鮻耳石高锶标记环的宽度与水体中Sr／Ca是呈对数关系变化的。在高锶海水标记下鮻耳石形成标记环的宽度其实与锶元素在鱼类耳石沉积的时滞特征有关［25－26］，考虑到本实验期间鮻仅在标记期间海水Sr2＋浓度不同，因此本实验不同处理组之间标记环宽度的差异只可能与标记浓度、鮻耳石的生长规律有关。鮻耳石随个体发育生长而增大，二者呈幂函数关系，幂指数小于1，耳石初期增长率较大，后期渐缓［27］。而鱼类在不同Sr2＋浓度标记后，其耳石Sr／Ca恢复到正常水平所需时间的比较性研究尚未见报道。笔者推测，随着标记采用的Sr2＋浓度升高，高浓度Sr2＋在鮻耳石沉积的时滞越长，这些高浓度Sr2＋随着鮻的生长逐渐沉积，最终恢复到正常的耳石Sr／Ca水平［26，28］；但是这需要进一步深入研究加以证实。

关于海水鱼耳石微化学锶标记过程中采用的标记海水Sr2＋浓度的报道不多。大黄鱼在12 mg·L－1Sr2＋的海水中浸泡7 d，其耳石出现明显的锶元素指纹标记［22］。司飞等［17］在对牙鲆进行72 h耳石微化学锶标记的实验中发现，Sr2＋质量浓度为9.19 mg·L－1的海水未能成功标记，Sr2＋质量浓度为11.16 mg·L－1的海水仅对部分样品成功标记，而Sr2＋质量浓度为19.06 mg·L－1的海水成功标记了所有样品。由于本实验设计的最低标记浓度为50 mg·L－1Sr2＋，添加的锶元素远比文献中报道的添加浓度高，这也是本实验中所有标记组样品均出现明显“高锶标记环”的原因。依据实验结果，50 mg·L－1Sr2＋的标记浓度完全可以实现小规格鮻苗种大规模标记的需求。

虽然鱼类耳石中形成的锶标记稳定性强［17］且该方法非常适合于小规格苗种大规模标记，但是随着鱼类个体生长，其耳石逐渐变大，面分析检测比例尺变小，锶标记变细、模糊。为保持标记分析结果的清晰，放流评估回捕鱼类的面分析监测比例尺必须增大，尤其是标记环所处位置部分。本研究结果显示，1 cm鮻标记环出现的位置在距核200μm附近。因此，对回捕鮻进行面分析时，建议在距核100～300μm处加大面分析比例尺，以便准确分析回捕鮻是否是标记鱼类。