盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗生理特性和次生代谢产物的影响

洪森荣，陈轩宇，李文丽，张座栋，刘军，刘佳，蔡红，陈荣华

（1.上饶师范学院生命科学学院，江西 上饶 334001；2.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室/上饶市三叶青保育与利用技术创新中心/上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334001；3.上饶市红日农业开发有限公司，江西 上饶 334700）

三叶青（TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg）为葡萄科崖爬藤属植物，学名三叶崖爬藤，俗名金丝吊葫芦，中国特有的药用植物［1］，其地下块根的主要活性成分包括黄酮、多糖、山奈酚等，可清热解毒、祛风化痰、活血止痛，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等生物学功效，临床上用于治疗高热惊厥、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎等症，被誉为“安全有效的植物抗生素”［2］。怀玉山可谓是“天然药谷”，此处的三叶青成群落式分布，自古以来便是乡医郎中常用的一味退热良药［3］。

土壤盐渍化已经成为全球的生态环境难题，且由工业污染、不合理的农业灌溉、施肥等引起的次生盐渍化土壤面积仍在不断扩大，全世界约有20%的耕地遭受盐渍化胁迫，盐胁迫与植物的种子萌发、生长发育及分化密切相关［4］。盐胁迫下，植物会通过生理响应以减轻盐胁迫带来的影响［5］。但植物种类不同，其细胞组织结构和代谢机理迥异，盐胁迫下其生理响应机制和活性成分含量变化存在差异［6］。目前关于三叶青盐胁迫下生理响应和活性成分变化的研究尚未见报道。因此，本试验以‘怀玉1号’和‘怀玉2号’怀玉山三叶青试管苗为研究对象，从生理生化和次生代谢两方面开展其对不同浓度NaCl胁迫的响应研究，以确定2个栽培种的耐盐能力并揭示其在盐胁迫下的次生代谢产物（黄酮、多酚、多糖）含量变化规律，这不仅有利于促进怀玉山三叶青耐盐种质鉴定和筛选，而且对其大棚基质扦插高效栽培具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

怀玉山三叶青‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗，由上饶师范学院植物组织培养室提供，并由上饶市红日农业开发有限公司陈荣华高级农艺师进行种质鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫培养基的配制和试管苗的盐胁迫处理 盐胁迫试验选用的基础培养基为MS＋1.5 mg·L－1KT＋0.3 mg·L－1NAA＋30 g·L－1蔗糖＋6 g·L－1琼脂（pH 5.8～6.0），分别添加6种质量浓度的NaCl制得盐胁迫培养基。NaCl质量浓度分别为0、2、4、6、8、10 g·L－1。在超净工作台内切取‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗带2个腋芽、长约1.5～2.0 cm的茎段，接入上述6种固体培养基中，每瓶接种5～6个带芽茎段，每个处理接种16瓶；置于培养室中培养，培养条件为光照14 h·d－1，光照强度1 500～2 000 lx，温度（25±1）℃；盐胁迫处理60 d后结束试验，同时对其各项生理生化指标进行测定。

1.2.2 株高和生物量测定 株高用直尺测量；生物量参照Green［7］和Wu［8］等的方法测定，将6个盐胁迫处理的‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗洗净后分别放置于培养皿中，放入80℃烘箱6 h烘干至恒重，取出称量植株干质量。

1.2.3 有机渗透调节物质含量和相对电导率测定 选取6个盐胁迫处理的‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗叶片用于有机渗透调节物质含量和相对电导率测定。可溶性蛋白（SP）含量采用考马斯亮蓝G－250比色法测定［9］；游离脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量分别采用酸性茚三酮比色法和蒽酮比色法测定［10］；叶片相对电导率（RC）的测定参照Chen等［11］的方法。

1.2.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量测定 选取6个盐胁迫处理的‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗叶片用于抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的测定。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量的测定分别采用愈创木酚法［12］、氮蓝四唑（NBT）比色法［13］、紫外分光光度法［14］和硫代巴比妥酸（TBA）比色法［10］。

1.2.5 黄酮、多酚、多糖含量测定 2个栽培种试管苗叶片中的黄酮、多酚、多糖含量用屠玲艳［15］的方法测定。

1.3 数据统计分析

以上试验均重复3次，所有数据表示为平均值±标准差，并使用SPSS 19.0软件进行统计分析，用单因素方差分析（One－way ANOVA）及Duncan’s多重比较检验处理间的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗株高和生物量的影响

从图1可知，2个栽培种试管苗的株高和生物量均随着NaCl胁迫处理浓度的升高呈先升高后降低的趋势，‘怀玉1号’‘怀玉2号’分别在2～4、2～6 g·L－1NaCl范围内与对照差异不显著。低盐胁迫（2～4 g·L－1NaCl）对‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗的株高和生物量均有促进作用；除6 g·L－1NaCl对‘怀玉2号’株高还有一定促进作用外，中盐胁迫（6～8 g·L－1NaCl）和高盐胁迫（10 g·L－1NaCl）对‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗的株高和生物量起到显著抑制作用。特别是高盐胁迫（10 g·L－1NaCl）造成了2个栽培种部分试管苗的死亡。

图1 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗株高和生物量的影响

2.2 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗有机渗透调节物质含量和相对电导率的影响

从图2可知，随着NaCl胁迫浓度的升高，2个栽培种试管苗的可溶性蛋白、游离脯氨酸、可溶性糖含量均先升高后降低，‘怀玉2号’在6 g·L－1NaCl处理时达到峰值，‘怀玉1号’除可溶性糖含量在2 g·L－1NaCl处理时最高外均在4 g·L－1NaCl处理时达到峰值；而相对电导率持续升高。低盐胁迫（2～4 g·L－1NaCl）和中盐胁迫（6～8 g·L－1NaCl）均可显著提高‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗可溶性蛋白和游离脯氨酸的含量；中盐胁迫（6～8 g·L－1NaCl）也可显著提高‘怀玉2号’的可溶性糖含量，但对‘怀玉1号’可溶性糖含量的提高作用不显著；高盐胁迫（10 g·L－1NaCl）下，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’的可溶性蛋白含量、‘怀玉1号’的可溶性糖含量与对照差异不显著，而两者的游离脯氨酸和‘怀玉2号’的可溶性糖含量均显著高于对照。盐胁迫无论何种浓度均会造成怀玉山三叶青2个栽培种试管苗的相对电导率显著提高。

图2 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗有机渗透调节物质含量和相对电导率的影响

2.3 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

从图3可知，随NaCl胁迫浓度的升高，怀玉山三叶青2个栽培种的SOD、POD、CAT活性均先升高后降低，总体来说，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’的这三种酶活性分别在4 g·L－1和6 g·L－1NaCl胁迫时达到峰值。除高盐胁迫（10 g·L－1NaCl）下‘怀玉1号’的POD、‘怀玉2号’的CAT活性提高不显著外，NaCl胁迫处理均可显著提高‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗抗氧化酶活性。盐胁迫无论何种浓度均会造成怀玉山三叶青2个栽培种试管苗丙二醛含量的显著提高。

图3 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

2.4 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗叶绿素含量的影响

从图4可知，2～4 g·L－1NaCl对‘怀玉1号’、2～6 g·L－1NaCl对‘怀玉2号’试管苗叶绿素含量无显著影响，但NaCl浓度继续升高，2个栽培种试管苗的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均显著下降。

图4 盐胁迫对‘怀玉1号’（A）、‘怀玉2号’（B）试管苗叶绿素含量的影响

2.5 盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗生理生化指标的隶属函数分析

通过盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗的SP、Pro、SS、RC、SOD、POD、CAT、MDA的隶属函数分析，对怀玉山三叶青2个栽培种的耐盐性进行评价，结果（表1）表明，‘怀玉1号’除RC和MDA的隶属函数值高于‘怀玉2号’外，其余指标的隶属函数值均低于‘怀玉2号’，平均隶属函数值低于‘怀玉2号’。因此，‘怀玉2号’试管苗的耐盐性强于‘怀玉1号’。

表1 盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗生理生化指标的隶属函数分析结果

2.6 盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗生理生化指标的相关性分析和主成分分析

通过SPSS 19.0软件对各指标隶属函数值进行标准化处理，并对标准化值进行相关性分析，结果（表2）表明，SOD与Pro、POD与Pro、CAT与Pro、MDA与RC、POD与SOD、CAT与SOD、CAT与POD、CAT与SP之间极显著或显著相关，因此，SOD、Pro、POD、CAT、MDA和RC可以作为怀玉山三叶青2个栽培种试管苗耐盐性鉴定的指标。进一步对其进行主成分分析，结果（表3）表明，第1主成分对应较大的指标有MDA、RC、SS、POD、SP；第2主成分对应较大的指标有CAT、Pro、SP、POD、SOD；第3主成分对应较大的指标有SS。然后以每个主成分对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算怀玉山三叶青2个栽培种试管苗的综合主成分值作为综合得分，结果（表4）表明，‘怀玉2号’的耐盐性强于‘怀玉1号’。这与隶属函数法的评价结果一致。

表2 盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗生理生化指标的相关系数矩阵

表3 盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗 生理生化指标的主成分得分系数矩阵

表4 盐胁迫下怀玉山三叶青2个栽培种试管苗 生理生化指标的各主成分得分及综合得分

2.7 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗叶片次生代谢物含量的影响

从图5可知，随着盐胁迫的不断加重，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗叶片的黄酮和多酚含量呈先升后降趋势，并分别于4、6 g·L－1NaCl处理时最高，且总体来说，除高盐胁迫（10 g·L－1NaCl）处理的黄酮和多酚含量与对照差异不显著外，其他浓度处理均可增加黄酮和多酚的含量；而多糖含量则呈逐渐下降趋势，当NaCl浓度超过2 g·L－1后下降显著。表明，低盐和中盐胁迫有助于怀玉山三叶青2个栽培种试管苗叶片黄酮和多酚含量的提高，但NaCl胁迫导致叶片多糖含量下降。

图5 盐胁迫对怀玉山三叶青2个栽培种试管苗叶片次生代谢物含量的影响

3 讨论与结论

盐胁迫下，植株组织和器官等形态建成受阻，生长指标和生物量发生变化，是体现植物耐盐性最直观的指标［16，17］。在本试验中，低盐（2～4 g·L－1）胁迫下，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗长势正常，其株高和生物量增加，这是其积极应对逆境的一种生理响应，与柽柳［18］盐胁迫的结果较为一致。但在中盐（6～8 g·L－1）和高盐（10 g·L－1）胁迫下，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗叶片相对电导率显著上升，植株高度、生物量和叶绿素含量显著下降。光合色素含量下降的原因可能是盐胁迫对叶绿体结构造成了一定的破坏，提高了叶绿素酶的活性，促进了光合色素的分解［19］。

盐胁迫下，植物体内会积累大量的活性氧自由基如OH－和O·－2等，造成膜脂过氧化反应，MDA大量积累，膜结构完整和功能稳定性受到破坏［20］。SOD、POD和CAT等抗氧化酶类，可清除过量活性氧，抑制MDA积累，保证植物正常生长代谢［21］。在本试验中，随着盐胁迫浓度增加，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗的MDA含量也显著增加，相对电导率显著上升，表明中高盐胁迫下‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗体内会逐渐积累大量的活性氧自由基，膜脂过氧化，膜结构和功能受损，从而影响了‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗的生长，这与龙船花［22］在盐胁迫下的结果一致。

渗透调节作用也是植物适应逆境胁迫的重要生理机制之一。研究表明，盐胁迫下植物体内会积累大量有机渗透调节物质来维持较高的细胞质渗透压，增强其渗透调节能力，维持植物的正常吸水和代谢活动［23］。SP作为植物体内重要的渗透物质之一，直接反映盐胁迫对植物代谢所产生的影响［24］。Pro作为一种重要的有机渗透调节物质，可起到保护生物大分子、清除体内羟基的作用，还可作为植物抵抗盐胁迫对自身所造成影响最直接的氮源、碳源、还原剂［25］。SS也是一种重要的渗透调节剂，在逆境胁迫下，它对细胞膜和原生质体有一定保护作用，还可在细胞内无机离子浓度高时起保护酶类和促进Pro合成积累的作用［26］。在本试验中，随着盐胁迫浓度增加，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗的Pro、SP和SS均呈先升后降趋势，且显著高于对照或与对照相比无显著差异，说明‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗通过积累SP、Pro和SS使得细胞液浓度迅速升高，以便植物在盐胁迫逆境中提高细胞吸水和保水的能力，维持细胞正常的生理功能，从而提高‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗的耐盐性。

中药材的品质取决于药用植物活性成分的含量高低。药用植物活性成分合成与累积的主要诱导因子为逆境胁迫，且对逆境胁迫的响应因植物种类而异。研究发现，干旱胁迫可显著提高薯蓣属植物的总黄酮含量［27］，也可提高芝麻中总黄酮、总多酚的含量［28］，还可有利于烟草酚类、生物碱等物质的积累［29］。本试验也表明，随着盐胁迫的不断加重，‘怀玉1号’和‘怀玉2号’试管苗叶片的黄酮和多酚含量呈先升后降趋势，而多糖含量则呈逐渐下降趋势，这说明盐胁迫会增强三叶青的次生代谢，促进次生代谢产物累积，而多糖含量显著下降可能是由于植物体通过分解体内多糖，提高可溶性糖含量，以此调节细胞渗透压以适应盐胁迫带来的逆境压力。