脊髓和三叉神经脊束核尾侧亚核投射神经元亚群负责痛觉和痒觉信息加工

研究表明，初级传入神经元和脊髓中间神经元类群具备区分痛觉和痒觉刺激模式的功能。然而，机体对特定刺激模式的感知并非源于脑对中间神经元活动的分析，而是源于脑对不同投射神经元类群活动的分析。因而，针对初级传入神经元和中间神经元的异质性和特异性的探究，已经拓展到脊髓背角和三叉神经脊束核尾侧亚核 (TNC) 的投射神经元。解剖学研究鉴定了脊髓背角I层的3种形态学不同的投射神经元，提示其可能具有功能异质性。然而，有观点认为在分子水平上投射神经元是相对同质性的（尽管也有反对的证据）。神经激肽1受体 (NK1R) 一直被认为是脊髓背角I层和脊髓外侧核 (LSN) 投射神经元的主要标志分子。最近研究表明

和

两个基因定义了大量的投射神经元（靶向臂旁核），其在传递不同疼痛刺激模式中发挥重要作用。近来，采用无偏向的单细胞转录组学技术鉴定出一类兴奋性神经元群体（表达Glut15），其中也包括了表达NK1R的脊髓-臂旁核投射神经元。该研究中作者采用系列连续的过滤筛选步骤，鉴定出几种不同分子类型的投射神经元亚群，并探究了这些神经元亚群传递痛觉和痒觉信息的功能异质性。

首先，该研究采用基于复制缺陷的逆行单纯疱疹病毒 (HSV) 构建了编码绿色荧光蛋白(GFP) 标记的大核糖体亚单位蛋白L10 (HSV- GFPL10)的病毒载体。该病毒载体被注射到小鼠的臂旁外侧核(LPb)中，诱导脊髓和TNC到臂旁核的投射神经元表达GFP-L10，进而可以对投射神经元特异性的RNA进行纯化并测序。在平行研究中，作者将编码一个Cre重组酶依赖的HA标记L10 (HSV-flex-HAL10)的病毒载体注射到NK1R-Cre小鼠的LPb中（从注射HSV-GFPL10和HSV-flex-HAL10的小鼠中获得的数据集，在后文中称作“PN”或“NK”数据集）。2周后分别在野生型和NK1R-Cre小鼠的脊髓和TNC投射神经元中记录GFP-和HA-标记的核糖体，并通过标记的核糖体和相关mRNA免疫沉淀反应 (IP) 实验证实特异性免疫标记的投射神经元。

在qPCR实验验证上述IP对投射神经元的特异性后，作为第一步筛选步骤，对所有IP（GFP或HA标记的核糖体）和输入样本（脊髓背角和TNC）进行核糖体RNA测序，绘制“PN”和“NK”数据集内以及相对于另一数据集的基因表达倍数变化图。鉴于脊髓到臂旁核所有的I层投射神经元约90%表达NK1R，作者猜想这两个数据集有很大程度的重叠且大部分数据点应位于第一和第三象限，观察到的结果也证实了他们的猜想。同时，在成年小鼠NK1R亚群（而不是非NK1R亚群）的投射神经元中还观察到Phox2a的富集。采用荧光原位杂交 (ISH)对投射神经元标记基因进行第二步筛选，主要关注几个位于第一象限且在PN或NK的RNA-seq和qPCR数据集中富集的与疼痛和/或痒觉信息处理相关的基因。首先从TNC中的投射神经元开始分析，

基因编码的胆囊收缩素是一种具有抗阿片作用的物质。采用HSV-GFPL10逆行标记LPb投射神经元，并对TNC内的

和

进行双荧光ISH，证实了在

投射神经元中富集表达

基因。同时还观察到大量

/

神经元，表明大多数

细胞是中间神经元，脊髓背角也呈现出类似的表达模式。神经元正五聚蛋白2 (

) 基因与多种神经精神障碍及疼痛信息的处理有关。与

类似，该研究还观察到大量的

/

神经元，表明绝大多数

细胞是中间神经元。Neuromedin B (

) 是蛙皮素样多肽家族的一员，并与疼痛和痒觉信息的处理有关。作者发现

在TNC中表达较少，且主要表达在浅层，其中一部分是

的LPb投射神经元。促肾上腺皮质激素释放激素基因(

) 与外周和中枢疼痛信息处理有关。作者观察到TNC浅层中存在

/

的LPb投射神经元。

为了确定这些与投射神经元相关的基因在NK1R神经元亚群中的表达情况，对

和每个富集的基因进行了双荧光和三荧光的ISH实验。采用逆行示踪荧光微粒直接标记投射神经元，并观察

与富集基因共表达的细胞及只表达该基因或

的细胞。观察到脊髓背角深层存在

/

神经元，而I层则几乎没有。另外，在背角浅层和深层均观察到了

与

、

和

共表达的神经元，当然也有很多只表达

或者富集基因的神经元。对

、

和

进行三荧光ISH，观察了表达每种基因组合的神经元亚型，并提出

的神经元至少包含4个亚群：

、

、

和

。实际上，表达NK1R的投射神经元群体并不是同质性的，而

只是不同投射神经元类群的一个标志基因。近来研究发现，表达NK1R的投射神经元亚群也表达P物质（由

编码）。该研究还发现

和

共表达在投射神经元亚群中。

该研究通过Fos表达变化来监测逆行标记的投射神经元亚群对疼痛刺激（将小鼠后脚掌置于50℃水中）或痒觉刺激（小鼠脸颊注射5.0 μg/μl氯喹）的反应性。小鼠接受刺激20分钟后，对其腰段脊髓和TNC进行三重荧光标记ISH实验。结果显示，刺激同侧的脊髓浅层（I/II层）和III/IV层观察到了热诱导的

神经元，并且这两个区域均观察到了

和

共标的投射神经元。平均约27%的

投射神经元和约50%的

投射神经元对伤害性热刺激有反应。在记录到少量

或

细胞中，约27%的

投射神经元和约50%的

投射神经元对伤害性热刺激有反应。氯喹介导的

表达变化在刺激同侧的TNC浅层最显著。TNC中对氯喹有反应的投射神经元中，有约29%的

投射神经元，约36%的

投射神经元，约32%

投射神经元和28%

投射神经元。与氯喹反应性的

神经元有所不同，

神经元主要分布在I层。结果表明，在脊髓背角和TNC的投射神经元中，表达

、

、

和

的每个投射神经元亚群中，约有三分之一对热刺激和/或氯喹有反应。

该研究采用TRAP2（活性类群神经元靶向重组）小鼠来实现激活神经元的可视化。在小鼠暴露于特定时间内的刺激后，被激活的神经元以Cre和Fos依赖性方式永久表达tdTomato (

) 红色荧光。在小鼠注射4-OH-他莫西芬前1周，在LPb中注射荧光金 (FG)，从而实现对投射神经元中汇聚处理刺激信息的分析。结果显示，

荧光和

免疫反应性在刺激同侧的脊髓背角最显著，

三标的投射神经元主要分布于I层。而

双标的中间神经元主要位于II层。I层和V层中存在只对伤害性热刺激有反应的其他投射神经元（如

/

神经元）和只对痒觉刺激有反应的其他投射神经元（如

/

投射神经元）。结果表明，大部分投射神经元对两种刺激的其中一种有反应。只对热刺激有反应的投射神经元主要分布在I层和II层，而只对氯喹有反应的投射神经元在脊髓各层都有分布。同一投射神经元亚群既传递疼痛也传递痒觉信息给大脑，也存在对疼痛或痒觉或对其他刺激更具选择性的神经元亚群。

最后，该研究发现大多数投射神经元表达NK1R以及一个或多个标记基因，然而TRAP2分析表明这些投射神经元也具有功能异质性。目前认为，初级感觉神经元和脊髓背角的中间神经元是异质性的，即它们选择性地对疼痛和/或瘙痒刺激作出不同程度的反应。有证据表明，传递痛觉和痒觉信息的投射神经元在分布、投射靶标、形态学和电生理特性上呈现多样性。该研究表明，投射神经元亚群存在分子和功能异质性，可以通过其在脊髓背角和TNC中的基因表达、空间位置以及对疼痛或瘙痒刺激的反应性来进行区分。

1.1 对象 2012年2月13—20日对全院临床护士进行调查。入选标准:临床科室护士，排除标准:进修等非本院护士。选取10个科室共158名护理人员。年龄22～50岁，平均年龄(31.7±7.2)岁;工作年限1～29 年，平均(10.3 ±8.4)年;学历:中专 15 名，大专103名，本科37名;职称:护士65名，护师52名，主管护师(包括护士长)37名。

为了整合理解投射神经元的分子异质性与功能异质性，对受到疼痛或瘙痒刺激的TRAP2小鼠脊髓背角组织进行多色非定量ISH分析。在注射4-OH-他莫西芬后，首先通过向小鼠后爪注射氯喹来激活痒觉反应神经元，1周后将同一只后爪浸泡在50℃的水中激活痛觉反应性神经元。在氯喹刺激1周前，这些小鼠LPb注射逆行示踪荧光微粒标记投射神经元。在第2次刺激后，对

（标记瘙痒反应神经元）、

（标记疼痛反应神经元）、

、

、

和

基因进行多色ISH。在脊髓背角浅层、深层以及LSN中，观察到仅对疼痛刺激有反应的投射神经元（即

/

投射神经元），同时也存在只对痒觉刺激有反应的神经元。此外，有一些投射神经元对疼痛和瘙痒的刺激均有反应，而另一些对两者均无反应。

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假定阈值λ可以将所有温度变量分类到fλ个分组中,即u1,u2,…,ufλ。如果第i个分组ui包含q个温度变量,则在分组ui(i=1,2,…,fλ)中的每个温度变量序列可以表示为:

综上所述，该研究首次对投射神经元亚群的分子标签和功能特性进行了系统研究。首先对投射神经元进行RNA测序，获得投射神经元候选标记基因的数据集，接下来结合逆行追踪和多色原位杂交鉴定出一些新的标记基因。最后，采用TRAP2小鼠进行了功能研究，评估疼痛和瘙痒刺激下投射神经元的反应程度，并阐明了分子多样性的投射神经元类群亦具有功能异质性。该研究报道了疼痛和痒觉信息在表达NK1R和不表达NK1R的不同投射神经元亚群中的信息汇聚。这与痛觉和痒觉信息处理的群体编码模型相吻合，然而在痛觉和痒觉的产生过程中，如何整合专一线路(a labeled line)与使用群体编码的投射神经元的输出以及大脑如何解读这些信息，仍有待进一步探究。