模拟酸雨胁迫对黑果枸杞种子萌发特性的影响

聂必林，吕海英，如马南木·尼合买提，赛比热尼沙木·莫尔扎提

（1新疆师范大学生命科学学院，乌鲁木齐830054；2干旱区植物逆境生物学实验室，乌鲁木齐830054；3新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，乌鲁木齐830054）

0 引言

酸雨在科学上称为酸沉降，通常是指pH＜5.6的降水[1,2]。酸雨是由雨、雪等在形成和降落过程中，溶解了大气中的硫化物，氮氧化合物等物质，形成的pH＜5.6酸性降水[3]。近200年来，随着工业化进程的加快，排放在空气中的二氧化硫、氮氧化合物等物质激增，导致酸雨在全球范围内的分布越来越广，酸雨污染问题逐渐成为了全球性的重要环境污染问题之一[4-6]。中国已经成为继北美洲和欧洲的全球第三大酸雨覆盖区[7-8]，其发生面积超过了中国国土面积的40%[9-10]。针对国内酸雨状况学者们做了大量研究，张新民[1]等研究认为，国内酸雨区主要分布于华北地区、东北地区东南部、西南和华南沿海地区以及新疆北部地区；刘新春[11]等研究认为，新疆南疆城市的酸雨远少于北疆城市，且北疆城市的酸雨pH平均值有逐年缓慢降低的趋势；任泉[12]和刘亚民[13]等研究发现，乌鲁木齐大气降水的酸雨频率为5.8%，每年的1～3月酸雨污染最为严重。酸雨通过改变土壤理化环境影响植株生长或通过淋溶等方式直接损害植物的叶、花、果实等器官以及抑制种子萌发[14]。而种子萌发期是植物生活史中对外界环境刺激最为敏感的阶段[15]，直接决定了植株能否正常生长，因此，探究种子萌发对酸雨胁迫的响应至关重要。

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)是一种多年生的茄科(Solanceae)枸杞属(Lycium)多刺灌木植物[16-17]，是国内西北地区极其重要的经济植物，具有极高的药用价值[18]和生态学价值，这些优良医药价值主要源于其果实内含有像多酚、类黄酮等多种生物活性物质[19]，多酚类物质具有清除体内自由基、抗机体衰老等特性[20]，类黄酮如原花青素和花色苷具有降血脂、抗氧化、抗突变、抗炎、提高机体免疫力等多种生物学活性[21-24]；生态学价值体现于黑果枸杞植株具有抗寒、抗旱、耐土壤贫瘠、耐盐碱等生物学功能，常作为荒漠干旱区治理盐碱地土壤、防风固沙、保持水土的优选树种[25-26]。国内外对黑果枸杞的研究多集中于其果实的药理分析和化学成分分析，对黑果枸杞资源种植的研究相对较少。笔者以黑果枸杞种子为材料，探究不同pH的模拟酸雨对黑果枸杞种子萌发的影响，旨在为黑果枸杞播种育苗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试材料 供试黑果枸杞种子于2019年9月采自新疆库尔勒市哈拉玉宫乡，为多年生人工种植。种子采集后人工去除果肉，漂洗干净并自然风干后保存于5℃冰箱中备用。

1.1.2 模拟酸雨配置 将浓硫酸与浓硝酸按摩尔比5:1的比例配制成pH 1.0的酸溶液作为母液，然后取适量母液，用蒸馏水分别稀释成pH 2.0、3.0、4.0、5.0的模拟酸雨溶液，以不添加任何酸溶液的蒸馏水处理作为对照(CK，pH 6.5)，并用PHS-3C精密酸度计进行校准。

1.2 实验设计

实验于2019年11月25日在新疆师范大学生命科学学院生地楼干旱区植物逆境生物学实验室进行。挑选适量籽粒饱满、大小均一的黑果枸杞种子，用0.5% NaClO3消毒30 min，去离子水反复冲洗3～5次，置于滤纸上晾干后，于45℃恒温水浴锅中催芽48 h备用。取直径120 cm的培养皿25个，在每个培养皿中平整的铺2层经高温消毒的滤纸，在滤纸上均匀摆放50粒催芽处理后的黑果枸杞种子，每皿分别施加5 mL pH 2.0、3.0、4.0、5.0的模拟酸雨溶液和pH 6.5的蒸馏水，每个处理5次重复。将全部培养皿置于RXZ智能型人工气候箱（宁波江南仪器厂），设置光照强度2000 lx、温度(25±1)℃、相对湿度70%、昼夜周期16 h/8 h。在萌发过程中，每3天更换一次酸胁迫处理液，期间每日利用称重法补充蒸发掉的水分，保持各处理浓度稳定。

1.3 萌发指标测定

从培养第2天开始记录种子萌发情况，以后每24 h记录一次。连续7天没有种子萌发时结束实验，从每个培养皿中随机选取5株（不足5株的全部选择）发芽幼苗，用蒸馏水清洗干净并用吸水纸吸干表面水分，将胚根和胚芽分离开，用电子天平(Mettler Toledo-AL204)称量出幼苗胚根鲜重，然后利用游标卡尺测定幼苗胚根长(LR)和胚芽长(LG)。

根据实验数据计算发芽率(GP)、相对发芽率(RGP)、发芽势(GR)、相对发芽势(RGR)、发芽指数(GI)、相对发芽指数(RGI)、活力指数(VI)、相对活力指数(RVI)、平均发芽时间(AGT)、异状发芽率(HGP)、相对酸害率(RADR)、胚芽比(RTGR)，计算如式(1)～(12)。

式(1)中，Ni为第i天发芽数，N为种子总数。式(5)中，Gt为第t日发芽种子数，Dt为对应Gt的发芽天数。式(6)中，S为实验结束时胚根平均鲜重。式(9)中，d表示从播种之日起到种子萌发所用天数，n表示对应各日新增发芽种子数。式(10)中，异状发芽指长出胚根而胚芽生长异常或胚根及胚芽有明显损伤的种子，表示逆境对种子萌发的伤害效应。式(11)中，对照组正常发芽种子数是对照组发芽种子总数与对照组异状发芽种子数的差值，实验组正常发芽种子数是实验组发芽种子总数与实验组异状发芽种子数的差值。

1.4 数据分析

实验数据用Microsoft Excel 2019和SPSS 19.0进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨对黑果枸杞种子发芽率(GP)及发芽势(GR)的影响

GP和GR是评价种子发芽能力和种子质量等级的重要指标之一。结合图1及表1分析发现，黑果枸杞种子的GP、GR均在pH 5最大，且GP在pH 5、pH 4时与CK(pH 6.5)差异不显著，GR在pH 5、pH 4差异不显著。与CK相比，pH 5时GP增加了1.08%，pH 4、pH 3、pH 2时GP分别降低了2.16%、56.76%、92.97%；pH 5、pH 4时GR分别提高了37.70%和27.87%，pH 3、pH 2时GR分别降低了44.26%和91.80%。

表1 不同pH处理下黑果枸杞种子的每日萌发率 %

RGP和RGR能够更加直观地反映种子发芽能力和质量。结合图1及表1分析发现，黑果枸杞种子的RGP在pH 5时高于CK，其余pH条件下均低于CK，且pH 5、pH 4时与CK差异不显著；RGR在pH 5、pH 4时高于CK，pH 3、pH 2低于CK，各pH之间均差异显著(P＜0.05)。综上，轻度酸雨胁迫对黑果枸杞种子的GP、RGP、GR、RGR具有一定程度促进效果，当pH低于某值时产生抑制，抑制效果随pH减小而增强。

图1 不同pH处理下黑果枸杞种子的发芽率和发芽势

2.2 模拟酸雨对黑果枸杞种子发芽指数(GI)及活力指数(VI)的影响

种子的GI、RGI、VI、RVI可以用来衡量植物在一定条件下的发芽能力和活力。从图2可以看出，黑果枸杞种子的GI和RGI随pH减小而先升后降，均在pH 4时最大，且pH 5、pH 4差异不显著，两者均显著大于CK(P＜0.05)，pH 3、pH 2显著小于CK(P＜0.05)。黑果枸杞种子的VI和RVI在pH 5时最大，与CK差异不显著；pH≤5时，VI及RVI均随pH减小而降低，当pH 2时，VI、RVI接近于零。综上，轻度酸雨胁迫对黑果枸杞种子的发芽能力和活力有一定促进作用，重度酸雨胁迫产生抑制作用，且pH越小抑制越明显。

图2 不同pH处理下黑果枸杞种子的发芽指数和活力指数

2.3 模拟酸雨对黑果枸杞种子胚根长(LR)和胚芽长(LG)的影响

如图3所示，随pH减小，黑果枸杞种子的LR和LG逐渐减小，LR在pH 5时与CK(pH 6.5)差异不显著，pH 4、pH 3、pH 2时分别显著降低了37.09%、68.80%、81.23%(P＜0.05)；LG在pH 5、pH 4、pH 3、pH 2较CK分别降低了6.95%、64.31%、83.66%、92.97%，各pH间均差异显著(P＜0.05)。RTGR随pH减小逐渐增加，各pH间均差异显著(P＜0.05)。这些结果表明酸雨胁迫对黑果枸杞种子的胚根和胚芽生长具有抑制作用，酸性越强抑制越明显，且对胚芽的抑制作用强于胚根。

2.4 模拟酸雨对黑果枸杞平均发芽时间(AGT)的影响

从表1可以看出，各pH条件下，黑果枸杞种子的发芽期在播种后的第4～12天之间，集中在第6～9天。结合图3D分析发现，黑果枸杞种子的AGT随pH减小整体上呈现先降后升、再降再升的趋势。pH 5时AGT出现第1次极小值（7.04天），较CK显著降低了12.61%(P＜0.05)；pH 4时AGT略有回升，但较CK显著降低了9.38%(P＜0.05)，pH 3时AGT出现第2次极小值（7.10天），较CK显著降低了11.90%(P＜0.05)；pH 2时，AGT回升明显，较CK显著降低了3.60%(P＜0.05)。以上说明适度酸雨胁迫能显著提高黑果枸杞种子的发芽速度。

图3 不同pH处理下黑果枸杞种子的平均发芽时间和胚芽比

2.5 模拟酸雨对黑果枸杞种子异状发芽率(HGP)和相对酸害率(RADR)的影响

由图4A可见，黑果枸杞种子的HGP随pH胁迫程度增加呈现明显上升趋势。在CK和pH 5时，黑果枸杞种子的HGP分别为3.25%和5.24%，且两者差异不显著；当pH 4时，黑果枸杞种子的GP与CK没有显著差异，但HGP与CK差异显著(P＜0.05)，约有半数萌发种子为异状发芽，HGP表现为43.09%；当pH 3时，黑果枸杞种子有轻微霉变，绝大多数已经发芽的种子在实验结束时已死亡或接近死亡，HGP达到86.08%；当pH 2时，黑果枸杞种子全部霉变而几乎不发芽，极少数发芽的种子也表现为异状发芽，HGP高达100%。说明不同程度酸雨胁迫均会提高黑果枸杞种子的HGP，但轻度酸雨胁迫下的HGP提升不显著。

图4 不同pH处理下黑果枸杞种子的相对酸害率和异状发芽率

由图4B分析发现，随酸胁迫程度增加，黑果枸杞种子的RADR逐渐升高。pH 5时，RADR为0.78%，与CK差异不显著；pH 4时发芽率较CK没有显著差异，但约有半数的发芽种子胚根被轻微灼烧，RADR约为41.95%；pH 3、pH 2时，黑果枸杞种子活性被严重抑制，发芽种子数量很少，即使已发芽的种子胚根也被明显灼烧，RADR分别达93.84%和100%。

3 结论与讨论

植物抗酸性的大小是一种综合性状的表现，受植物体多种因素的共同控制[27]，而种子萌发是植物生长发育和接受酸雨胁迫的起点[28]，决定了植株能否正常建植生长，因而弄清酸雨胁迫对种子萌发的影响至关重要。

本实验分析发现，不同程度的模拟酸雨胁迫对黑果枸杞种子萌发均有影响。GP、RGP、GR、RGR、GI、RGI、VI、RVI指标在轻度(pH 5)、中度(pH 4)胁迫下与CK差异不明显；重度(pH 3)、超重度(pH 2)胁迫下与CK具有显著差异(P＜0.05)。这可能是因为轻、中度模拟酸雨胁迫时，弱酸性条件促进了种子内部蛋白质和淀粉的水解，或者模拟酸雨的氮、硫肥料效应抵消了H+对种子萌发的负面影响；随胁迫程度继续增加，过量H+使种子的种皮透性增强，造成内部离子平衡失调，自由基积累，线粒体结构破坏，种子呼吸作用受到抑制，物质代谢出现紊乱，储存的营养物质优先用于种子的损伤修复[29-31]，表现为各指标急剧降低。LR、LG指标随胁迫程度增加而逐渐降低，pH 5时与CK差异不明显，其他pH胁迫下均差异显著(P＜0.05)，RTGR指标随胁迫程度增加逐渐升高，且各pH间均差异显著(P＜0.05)，说明模拟酸雨胁迫对黑果枸杞种子的胚根和胚芽生长具有抑制作用，且对胚芽的抑制强于胚根。分析原因可能是根尖和芽尖细胞十分幼嫩，细胞壁没有完全形成，环境中过量的H+使根尖细胞和芽尖细胞的细胞壁酸化，酸化后的细胞壁变得松弛，水分子通过渗透进入细胞原生质体，细胞因此膨胀，当H+浓度高到一定量时，细胞过度膨胀而破裂，胚根和胚芽的生长受到严重影响。不同程度酸雨胁迫下，AGT均显著低于CK(P＜0.05)，在pH 5时最低，说明酸雨胁迫能显著缩短黑果枸杞种子的萌发时间。分析原因可能是酸性条件加速了黑果枸杞种子内蛋白质和淀粉等营养物质的水解，使种子的萌发速度加快，但过高H+浓度又对种子产生毒害作用，发芽速度受到抑制，实际发芽速度的变化取决于促进和抑制作用之和。这与王秀英等[32]酸雨胁迫对小麦种子萌发的研究结果并不一致，这可能与作物种类、种子发芽实验方法、酸雨处理方式、酸雨离子组成及比例等有关。HGP、RADR指标随酸性强度增强逐渐升高，HGP在pH 5时与CK差异不显著；RADR在各pH间均差异显著(P＜0.05)。分析原因可能是幼苗的胚根和胚芽比种子状态更为敏感，尽管某些耐酸性强的黑果枸杞种子能先长出胚根（视为发芽种子），但随胁迫程度增加，胚根被灼伤，甚至胚芽不能长出或长出异常，表现为HGP和RADR快速升高。

本研究结果表明，不同程度的酸雨胁迫对黑果枸杞种子萌发期GP、RGP、GR、RGR、GI、RGI、VI、RVI、LR、LG、RTGR、AGT、HGP、RADR指标均有影响。其中轻度(pH 5)酸雨胁迫对萌发生长影响不大，且在一定程度上缩短了种子萌发时间；中度(pH 4)酸雨胁迫对种子GP、RGP、GR、RGR、GI、RGI、VI、RVI没有明显影响，但HGP和RADR显著提升；重度及以下酸雨胁迫对种子萌发均具有明显抑制作用。因此可认为，黑果枸杞种子对弱酸雨胁迫具有一定的耐性，适当弱酸性环境更适合黑果枸杞种子萌发，在实际种植过程中，可利用这一特征来缩短黑果枸杞的育苗时间。当然，除了酸度的影响外，酸雨胁迫对植株的影响还与硫素及氮素比值有关[33]，如冯丽丽等[34]研究认为低硫氮比可能会减缓阔叶树种香樟、木荷等的负面作用，而本实验只针对黑果枸杞种子萌发在硫氮比为5:1时做了初步探究，其他硫素及氮素配比对黑果枸杞种子萌发和幼苗生长的影响及作用机制还有待进一步研究。