肝细胞性肝癌患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞异常表达危险因素分析

陈忠彪，周大臣，侯 辉，张 彬

(安徽医科大学第二附属医院胆外胰外科一病区，安徽 合肥 230601)

肝细胞性肝癌(hepatocarcinoma，HCC)是全世界第四大癌症死亡原因。2018年，全球约有84.1万例HCC新发病例，78.2万例死亡病例[1-2]。目前肿瘤切除是HCC治疗最有效的方法之一，但其术后复发率较高，5 a无病生存率仅为20%[3]。调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类在表型上和功能上与众不同的T细胞亚群，可调节免疫反应使机体保持免疫状态的平衡[4-5]。Treg细胞的消耗可增强肿瘤细胞耐受机体免疫的能力，并抑制肿瘤生长[6]。有研究显示，HCC患者循环血液系统和肿瘤浸润微环境中Treg的比例显著高于健康人群，而且Treg被优先富集在HCC患者外周血、肿瘤组织及癌旁组织并不断克隆增殖[7-8]。有研究报道，体外诱导Treg细胞可以促进HCC细胞的生长、克隆，并促进肝癌细胞对索拉菲尼耐药性的形成[9]。CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞是Treg中具有免疫抑制能力的T细胞亚群，可抑制效应T细胞，帮助肿瘤逃脱免疫监视[6]。CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞百分比(CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞)增高对自身免疫性疾病和变态反应的治疗以及预防同种异体移植排斥反应有益。因此，本研究以CD127low作为Treg细胞的筛选标志物，观察HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞的变化，分析其增高的影响因素，以期得到HCC患者肿瘤免疫逃逸的影响因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年8月至2020年5月安徽医科大学第二附属医院肝胆外科收治的103例HCC患者为研究对象，其中男86例，女17例；年龄22～86(59.00±11.7)岁。所有患者经影像学及病理学检查确诊为HCC,术前未行放射治疗、化学治疗及动脉栓塞治疗，且无其他基础疾病及肿瘤。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器淋巴细胞分离液购自天津市灏洋科技生物有限公司，CD3-藻红蛋白-花青苷5(phycoerythrin cyanin 5，PC5)、CD3-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)购自天津协科生物技术有限公司，CD4-PC5、CD4-FITC、CD19-FITC、CD20-藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)、CD25-FITC购自美国Introgen公司，CD45-PC5、CD127-PE购自美国eBioscience公司，红细胞裂解缓冲液、细胞染色缓冲液购自美国珀金埃尔默公司，磷酸盐缓冲液购自美国Gibco公司；高速低温离心机购自美国Eppendorf公司，CytoFlex流式细胞仪购自美国BD公司，涡旋振荡器购自上海生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集(1)一般资料：包括性别、年龄、体质量、高血压及糖尿病等；(2)既往病史：包括腹部手术史、感染病史、免疫治疗史等；(3)治疗前实验室检查：包括血常规、肝功能、凝血功能、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)及甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)等；(4)术后患者肿瘤病理情况：包括肝硬化、包膜完整性、肿瘤数目、肿瘤直径、血管侵犯及门静脉栓子等。

1.3.2 外周血免疫细胞亚群测定HCC患者于入院治疗前抽取清晨空腹肘静脉血24 mL，乙二胺四乙酸三钾抗凝；分别取2个测定管用作Treg、T细胞亚群测定管，Treg测定管中加入CD25-FITC、CD4-PC5、CD127-PE各2.5 μL，T细胞亚群测定管中加入CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PC5 各2.5 μL和CD45-PC7 1.0 μL；然后，各测定管内分别加入全血50 μL，振荡混匀，室温避光标记15 min；加入500 μL溶血剂，振荡混匀，室温避光溶血10 min。2 000 r·min-1离心2 min，弃上清液，加鞘液500 μL，2 000 r·min-1离心2 min，弃上清液，加入鞘液500 μL,充分混匀，应用CytoFlex流式细胞仪检测免疫细胞，CytExpert软件分析CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞值。

2 结果

2.1 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞检测结果结果见图1。基于健康人群外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞参考值 4.29%～6.17%，82例HCC患者的CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞<6.17%(正常组)，21例HCC患者的CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞≥6.17%(异常增高组)。

A：HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高;B：HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞正常。

2.2 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的危险因素单因素分析结果见表1。CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高与AFP有关(P<0.05)，与HbsAg、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)-DNA、肿瘤数目、肿瘤直径、肝硬化、门静脉癌栓等因素无关(P>0.05)。

表1 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的危险因素单因素分析

2.3 HCC患者CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高多因素logistic回归分析结果见表2。将单因素分析中P<0.2的因素纳入多因素分析中，结果显示，CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高与AFP阴性、肝硬化、多发肿瘤有关(P<0.05)。

表2 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高多因素logistic回归分析

2.4 Nomogram 临床预测模型建立结果见图2。Nomgram图显示，肿瘤直径≥5 cm、肿瘤多发、合并肝硬化、伴有HBV-DNA<1 000 IU·mL-1、术前抗病毒治疗干预的HCC患者血清CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的概率增大；而HCC患者AFP阳性，其CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞增高的概率小。

图2 预测HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的危险因素Nomogram模型图

3 讨论

HCC是肝癌最常见的一种临床亚型，我国HCC发病人数约占全球新发病例的55%，所导致的疾病负担呈上升趋势[11]。HCC预后较差，5 a生存率较低，早期发现并及时给予治疗可提高患者生存率。目前，HCC最有效的治疗方式为手术完整切除，但术后常发生癌细胞转移，而癌细胞转移与HCC患者的自身免疫状态密切相关。研究发现，肝癌细胞可以逃避机体对肿瘤的免疫监视，从而发生癌细胞的转移[12]。

Treg几乎参与机体所有类型的免疫反应，其在肿瘤患者体内可抑制针对肿瘤的免疫反应，从而帮助肿瘤细胞躲避机体的免疫监视。肝脏本身是免疫器官，HCC为炎症相关肿瘤，因此，CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞与HCC的发生发展密切相关。研究发现，抑制体内Treg增高可以改善HCC患者的免疫状态[13]。有研究报道，HCC患者体内Treg的数量可影响抗体的免疫状态，伴Treg浸润的接受肝切除术的HCC患者具有较高的复发率，预后更差[14]。研究发现，HCC肿瘤微环境中CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞的增加与肿瘤大小和血管侵犯相关[7]。本研究结果显示，21例(79.6%)HCC患者血清中CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高；单因素分析结果显示，HCC患者血清中CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高与AFP相关，与HbsAg、HBV-DNA、肿瘤数目、肿瘤直径、肝硬化、门静脉癌栓等因素无关；多因素分析结果显示，CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高与AFP阴性、肝硬化、多发肿瘤相关。究其原因，可能与AFP的分子作用及肝硬化的发生机制相关，AFP能够降低巨噬细胞吞噬活性，刺激Treg的增殖，并诱导T细胞活性的调节。LU等[15]研究发现，树突细胞衍生的外泌体内富含大量AFP，而AFP可引发Treg减少进而导致小鼠的肝癌细胞生长迟缓；而在肝硬化患者中，Treg的数量明显增加，Treg可以抑制肝星状细胞的NK细胞脱颗粒，损害NK细胞的抗纤维化功能，促进肝硬化的进展[16]；SOLDEVILA等[14]研究也证实，HCC患者体内Treg显著增加，但其增加机制尚不明确。此外，本研究中发现，CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高与肝硬化有关。

本研究临床预测模型Nomogram图显示，HBV-DNA<1 000 IU·mL-1、术前抗病毒治疗的HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的可能性越大，而SOLDEVILA等[14]研究发现，HBV感染患者抗病毒治疗后其体内CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞数量明显减少；而大量研究报道，HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg数量高于正常人群，产生这种差异的原因可能是肿瘤刺激了CD4+CD25+CD127low T淋巴细胞增加，而这种刺激超过了抗病毒后CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞的减少[6-9]。另外，临床预测模型Nomogram图还显示，肿瘤多发、肿瘤直径≥5 cm的HCC患者体内CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的概率增大。已有研究证实，Treg数目与HCC患者预后呈负相关，且单发肿瘤、肿瘤直径越小的患者预后越好[10，17]。因此，在手术无法切除肿瘤或者针对HCC患者术后生存期无法达到预期时，在术前或免疫治疗前通过采用分子靶向治疗、射频消融治疗等降低HCC患者荷瘤数目及肿瘤直径，以调整机体免疫状态，可更好地延长患者的生存期及提高患者的生活质量；通过检测CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞也可以对治疗方式及治疗价值进行评估。

综上所述，HCC患者外周血中CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞发挥着免疫抑制作用，而HCC患者人群中仅有一部分患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高，且AFP阴性、肿瘤单发、肝硬化是HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞异常增高的危险因素，但这是否影响HCC患者的预后还需要进一步的随访证实。