油酸激活Src基因诱导Hela细胞增殖、迁移和侵袭的研究*

秦 虹，张晓玉，罗 旋，曾 晗，陈压西，杨 萍△

(1.重庆医科大学附属第二医院肿瘤中心 401336；2.重庆医科大学脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室脂质研究中心 400016)

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，呈现年轻化的趋势，极大地危害了女性生命健康。宫颈癌的发生、发展受多因素、多通路的调控。近年来研究表明，肥胖可能增加宫颈癌的潜在发病率[1]。膳食中脂肪摄入增加是导致肥胖状态的重要因素之一，且膳食脂肪可能是解释肥胖与宫颈癌发生、发展关系的潜在因素之一[2-3]。

目前，以“地中海食物”油酸为代表的单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)作为重要的抗肿瘤免疫营养物质已引起广泛关注[4-5]。研究表明，MUFA不仅能通过影响肿瘤细胞蛋白质及DNA合成、破坏肿瘤细胞生物膜结构，还能诱导肿瘤细胞自噬及凋亡等机制发挥抗癌作用[6]。但近年来也报道了一些相反证据，MUFA，特别是油酸，可以促进胃癌和乳腺癌细胞的增殖和迁移发挥促癌作用[7]。同时，病例对照研究结果表明，MUFA可能会增加患胰腺癌的风险[8]，提示油酸有促癌作用。影响宫颈癌预后最重要的因素是原位侵袭和远处转移，因此，抑制肿瘤的侵袭和转移是宫颈癌防治的关键。Src基因是在人类中较早发现的有内在酪氨酸激酶活性的原癌基因。Src蛋白激酶作为一种不需要受体和膜相关信号转导的酶类，对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和细胞分化均有调控作用，其异常活化及通路紊乱与肿瘤的高转移性和预后不良关系密切[9]。目前，Src蛋白激酶小分子抑制剂的抗癌作用研究已经进入了大量的临床试验阶段。本课题组前期研究结果发现，高油酸饮食喂养(含45%的橄榄油)能够促进裸鼠Hela细胞皮下成瘤并增加肿瘤转移率，并进一步应用生物信息学分析了可能参与该过程的一些核心基因及通路[10]。本研究旨在探讨高油酸饮食对Hela细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型的影响，以及在油酸刺激下Src通路的激活情况，为研究宫颈癌发生、发展的机制提供一定的依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞

人宫颈癌细胞株Hela，经过鉴定并由脂糖代谢性疾病重庆市重点实验室保存。

1.1.2试剂

胎牛血清购于阿根廷NTC公司；高糖DMEM培养基购于美国 Hyclone公司；油酸购于美国Sigma公司；牛血清清蛋白购于中国BBI生命科学公司；CCK-8试剂购于日本同仁公司；EdU细胞增殖试剂盒购于广州锐博公司；结晶紫染料购于美国Genview公司；基质胶购于美国B&D公司；兔抗人Src和p-Src抗体均购于美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

将含有10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM作为生长培养基，于含5% CO2、37 ℃饱和湿度条件下常规培养，每2天换液，取对数生长期细胞进行实验。细胞实验前12 h将生长培养基更换为含有0.2%牛血清清蛋白的培养基。

1.2.2油酸和Src激酶抑制剂SU6656配制

称取油酸钠(相对分子质量为304.45)粉末50 mg于1.5 mL EP管中,随后加入1 080 μL 0.1 mmol/L NaOH溶液，置于90 ℃以上水浴锅中加热溶解其间需不断摇晃，5～10 min待完全溶解后将溶液移入15 mL离心管中,并向其中加入5%牛血清清蛋白使最终体积为10.8 mL，此为油酸储存液(终浓度为15 mmol/L)，使用时用0.2%牛血清清蛋白稀释，获得0、5、10 μmol/L的工作液。SU6656配制时溶于二甲基亚砜(DMSO)，将其配制成浓度为1 mmol/L的溶液，使用时用0.2%牛血清清蛋白稀释，获得0.5 μmol/L的工作液。机制探讨实验使用油酸及SU6656处理，共分为4组，其中NC组不使用油酸及SU6656处理，油酸组用10 μmol/L油酸处理，SU6656组用0.5 μmol/L SU6656处理,油酸+SU6656组使用10 μmol/L油酸联合0.5 μmol/L SU6656处理。

1.2.3CCK-8实验

将对数生长期Hela细胞消化、收集、制备单细胞悬液，5 000个/孔的密度接种到96孔板中，每组设5个复孔。CCK-8实验于接种后6、24、48和72 h时间点进行检测。细胞贴壁后换成含有不同浓度油酸(0、5、10 μmol/L)的工作液处理，其中NC组不使用油酸处理，油酸组使用5、10 μmol/L油酸处理。检测时每孔添加CCK-8液10 μL并于37 ℃培养箱继续孵育2 h。

1.2.4EdU细胞增殖实验

将对数生长期Hela细胞以5 000个/孔的密度接种到96孔板中，每组设5个复孔。EdU实验时，细胞于96孔板孵育24 h后加入EdU培养基(EdU浓度为50 μmol/L)孵育，然后使用多聚甲醛固定，甘氨酸中和后用渗透剂[含0.5%Triton X-100的磷酸盐缓冲液(PBS)]于摇床孵育、清洗2次。随后加入1×Apollo染色反应液染色，依次用PBS、甲醇再清洗。后用试剂盒中Hoechst33342反应液进行细胞核染色。最后荧光显微镜计数并分析。

1.2.5平板克隆集落生成实验

对数期Hela细胞以每孔5 000个种于6孔板，用2 mL完全培养基培养，5 d后予以油酸(10 μmol/L)处理，10 d后于显微镜下观察集落形态，使用4%多聚甲醛固定细胞，用0.1%结晶紫染色，观察集落生长情况。

1.2.6Transwell迁移实验

取对数生长期细胞，PBS洗涤2次，用含不同浓度油酸的培养基调整细胞密度为2×105/mL，将100 μL细胞悬液加入8 μm的Transwell小室上室内，下室加入600 μL含10%胎牛血清的完全培养基，孵箱常规培养24 h后，取出Transwell小室，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室温固定30 min，然后于0.1%结晶紫中染色30 min，PBS清洗2次，以棉签小心擦除滤膜内面的细胞，用倒置显微镜在200倍进行拍照，用ImageJ软件计算穿膜细胞数。

1.2.7Transwell侵袭实验

将Matrigel用无血清高糖培养基按1∶3的比例稀释，取40 μL Matrigel于Transwell小室的上室中，均匀铺满小室底部的聚碳酯膜上，并置于37 ℃培养箱中孵育1 h待胶凝固。Transwell小室上室内加入细胞悬液100 μL(40 000个/孔)，下室加入600 μL完全培养基，将24孔板置于孵箱培养72 h后，取出Transwell小室，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗2次，以棉签小心擦除滤膜内面的细胞，用倒置显微镜在200倍进行拍照，用ImageJ软件计算穿膜细胞数。

1.2.8Western blot实验

用RIPA分别提取NC组和油酸处理组(10 μmol/L处理48 h)细胞的总蛋白，使用BCA试剂盒检测各种蛋白浓度后，确定上样量。于8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行等量总蛋白电泳，电转移于聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，在37 ℃条件下，3%牛血清清蛋白封闭1 h，随后分别加入1∶1 000稀释的Src和p-Src一抗，4 ℃摇床孵育过夜。次日用TBS-T清洗3次，每次15 min，接着加入1∶8 000稀释的兔抗二抗，室温摇床中孵育1 h，TBS-T清洗3次，每次15 min，随后用电化学发光(ECL)方法检测p-Src蛋白表达情况，用ImageJ软件定量分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 油酸促进Hela细胞的增殖

CCK-8实验显示：与NC组比较，油酸组细胞增殖率增高，且10 μmol/L油酸组增殖率明显高于5 μmol/L组(P<0.05)。平板克隆实验显示：与NC组比较，油酸组Hela细胞集落形成能力明显增加(P<0.05)，且Hela细胞形成的单个集落更大。EdU细胞增殖实验显示：油酸组EdU细胞阳性率较NC组升高[(37±1)%vs.(29±1)%,P<0.05]，见图1。

A：CCK-8实验；B：平板克隆实验；C：Edu细胞增殖实验;a:P<0.05，与NC组比较；b:P<0.05，与5 μmol/L油酸组比较。

2.2 油酸促进Hela细胞的迁移和侵袭

Transwell迁移实验和侵袭实验显示，与NC组比较，油酸组迁移和侵袭细胞数均明显增多，且10 μmol/L油酸组多于5 μmol/L油酸组(P<0.05)，见图2。

A：迁移实验；B：侵袭实验;a:P<0.05,与NC组比较；b:P<0.05，与5 μmol/L油酸组比较。

2.3 油酸能够刺激Hela细胞原癌基因Src激活

与NC组比较，油酸组p-Src蛋白表达水平明显增高(P<0.05)，见图3。

2.4 SU6656能抑制油酸对Hela细胞的促增殖作用

与油酸组比较，NC组、SU6656组和油酸+SU6656组增殖率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较，SU6656组与油酸+SU6656组增殖率升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

2.5 SU6656能抑制油酸对Hela细胞的促迁移及侵袭作用

NC组、油酸组、SU6656组和油酸+SU665组迁移细胞数分别为(11.2±5.5)、(28.5±14.8)、(13.1±7.0)、(13.3±10.7)个，油酸组多于另外3组，差异有统计学意义(P<0.05)。NC组、油酸组、SU6656组和油酸+SU6656组侵袭细胞数分别为(78.4±34.0)、(275.5±102.4)、(67.2±24.0)、(69.6±27.4)个，油酸组多于另外3组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5、6。

a:P<0.05,与NC组比较。

a:P<0.05,与油酸组比较。

a:P<0.05,与油酸组比较。

a:P<0.05,与油酸组比较。

3 讨 论

宫颈癌发病率呈逐年上升趋势，虽然包括手术、放疗、化疗在内的宫颈癌治疗技术不断改进，但晚期患者5年生存率仍低于50%[11]。宫颈癌的预后与癌细胞的侵袭和转移密切相关，侵袭和转移是造成其死亡最重要的因素。但对于晚期和转移的宫颈癌，治疗效果不佳，因此，研究宫颈癌预防与治疗方向也十分必要。

在癌细胞中，脂肪酸主要参与细胞膜的形成，细胞能量储存和信号分子生成及转导。此外，脂肪酸通过调节细胞转化和肿瘤发生的信号通路来影响癌症的发展。油酸在橄榄油中含量高达80%，富含油酸的橄榄油被认为是传统地中海饮食的关键营养成分，对心血管疾病的发生、发展产生保护作用。另外，流行病学研究表明橄榄油可减少乳腺癌和结肠癌发病率，且油酸与肝癌发生风险呈负相关[12]。但也有油酸促进癌症发生的证据，如油酸可增加葡萄糖的利用以促进胶质母细胞的增殖，油酸与结肠腺瘤的发生呈正相关。硬脂酰辅酶a去饱和酶1(SCD1)可将饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸，且SCD1已明确促进癌细胞增殖、迁移、转移等过程，所以使得油酸对癌症的影响尚存在争议，而目前针对油酸对宫颈癌的研究较少。

Src激酶是原癌基因c-Src的主要产物，为非受体酪氨酸蛋白激酶，目前发现的家族成员有11个，Src是目前研究最多的成员之一[13]。Src由SH4结构域、特定片段、SH3结构域、SH2结构域、连接段、SH1结构域(蛋白酪氨酸激酶结构域)和羧基端调节尾端组成。Src在细胞增殖、分化、运动和定位等细胞进程中都发挥重要作用。研究表明，Src通路激活参与了结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺等恶性肿瘤的进展[14]。Src激酶可参与多个信号通路，Src通路活化将激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途径或与其他信号通路之间的联系，对癌细胞的增殖、黏附及侵袭恶性表型有调控作用，其高表达或表达紊乱与某些肿瘤的高转移性和预后不良密切相关。有研究报道在结肠癌中，肿瘤组织与癌旁组织比较，结肠癌组织的Src失调主要涉及蛋白质过表达和通路过度激活[15]。在乳腺癌进展过程中，Src激活是表皮生长因子受体(EGFR)信号下游的关键事件，刺激周围组织的迁移和侵袭。实验研究证明抑制 Src激酶的活性或降低其表达可抑制多种癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时对肿瘤细胞耐药发挥积极作用。事实上，抑制Src激酶阻碍了一些肿瘤诱导表型的开关，包括刺激癌症相关成纤维细胞(CAFs)、血管生成和免疫浸润[15]。PP2为Src激酶抑制剂之一，其可于体外实验抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭等能力，且有浓度依赖性[16]，另外，有研究证明Src通路激活降低了卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，同时这种抗性可以通过药理学抑制Src来逆转[17]。目前，全国多中心已开始进行大量药物临床试验来评估实体瘤中的小分子Src家族抑制剂的抗癌作用[18]。SU6656是一种小分子吲哚酮，可特异性抑制Src激酶。由于其对Src的高度特异性，SU6656已成为Src相关信号转导研究的重要工具。YANG等[19]研究发现，在胃癌中，Src激酶活性与迁移、侵袭相关蛋白[如血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶(MMP)家族蛋白]活性有正相关性，用SU6656干预可实现体外逆转胃癌细胞的恶性表型。

迄今为止，大多数证据表明Src在侵袭性表型的维持中起主导作用，而不是在细胞周期进程中起主导作用。有研究提示油酸可通过ERK1/2的磷酸化激活并形成AP-1-DNA复合物促进乳腺癌细胞的增殖，而ERK1/2的激活和AP-1-DNA复合物的形成依赖于Src家族激酶的活性。目前关于Src及SU6656对宫颈癌的作用研究报道较少。因此，本研究通过Src激酶抑制剂SU6656干预Hela细胞，检测其侵袭和迁移能力的变化，以期为寻找抗肿瘤治疗的新靶点提供理论依据。

本研究结果显示，油酸对Hela细胞的增殖、迁移、侵袭能力有促进作用，且随浓度的增加效果越明显。通过蛋白水平检测，油酸可于体外刺激Src原癌基因表达，促进该通路激活。运用Src特异性抑制剂SU6656后，油酸对Hela细胞的促癌作用逆转。综上所述，Src激酶抑制剂在一定浓度油酸刺激下对Hela细胞的增殖、迁移和侵袭能力有抑制作用，但 SU6656抑制肿瘤侵袭和迁移能力的机制尚不清楚。因此，进一步探讨SU6656抑癌的分子机制将会对宫颈癌防治提供一定理论依据。