静态超高压制备黑茶多糖铁及其体外消化特性

贾时荣 何 洪 安凤平，2 曾绍校，2 宋洪波，2

(1. 福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2. 福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室，福建 福州 350002)

缺铁可导致缺铁性贫血或功能障碍，在所有年龄人群中都比较普遍[1-2]。第三代补铁剂是以铁螯合物存在的新型补铁剂，如多糖铁、多肽铁、氨基酸铁、血红素铁等，具有副作用低、胃肠道刺激性小和生物利用度高的特点[2-3]，因此成为新型补铁剂开发的重要方向。茶多糖(Tea Polysaccharides)是茶叶中一类具有生理活性的复合植物多糖，因与蛋白质结合在一起，又称为酸性糖蛋白[4]。茶多糖分子中存在大量的活性基团如羟基和羧基，使其具有良好的金属配位能力，易与金属离子螯合形成稳定的复合物[5]。近年来，有关多糖铁的合成、表征和生物活性的研究促进了多糖铁在食品补铁剂领域中的应用[6-7]。但有关黑茶多糖铁的制备及体外消化特性的研究尚未见报道。

多糖铁的传统制备方法为加热法，操作简单、条件易于控制，但制备时间较长，且多糖铁的铁结合率较低。Zhang等[8]利用DEAE纤维素-52柱层析法分离桑葚多糖得到3种多糖组分(MFP1、MFP2和MFP3)，再与FeCl3溶液于70 ℃反应1 h制备多糖铁螯合物。结果表明MFP1-Fe、MFP2-Fe、MFP3-Fe的铁含量分别为2.99%，2.54%，4.90%。Wang等[9]以鲍鱼性腺的硫酸化多糖(AGSP)为原料，于50 ℃水浴下与三价铁反应(4 h)制备AGSP-Fe。结果表明AGSP-Fe的铁含量为8.95%，模拟胃液中铁的释放量为36.6%，而模拟肠液中游离铁的含量先下降后稳定。张喜峰等[10]采用传统加热法(70 ℃处理1 h)制备了螺旋藻多糖铁，其铁结合率为16.42%，在pH 6.8的人工肠液中可溶性铁为83.64%。静态超高压技术具有升压速度快，压力传递均匀的特点[11]，能够改变植物多糖、蛋白质、淀粉等大分子物质的非共价键结构，但不会破坏其共价键结构[12]，可形成更利于新物质合成的空间构型。目前，静态超高压技术已被应用于多糖和蛋白质等大分子的改性领域。种晓[13]研究了静态超高压处理对复合蛋白抗菌膜性能的影响，发现超高压能够使蛋白质发生不同程度的解离和聚合，从而提高抗菌薄膜的机械性能。丁俭等[14]采用超高压技术对大豆蛋白/可溶性多糖复合物进行改性，并研究了复合物对乳液形成的影响。结果表明超高压处理改变了蛋白质的二级结构，促进其与多糖分子键合，进而改善复合物在油—水界面的吸附和提高乳液的稳定性。此外，Guo 等[15-16]利用静态超高压技术成功制备了莲子直链淀粉/脂肪酸复合物和莲子淀粉/茶多酚复合物。然而，关于静态超高压制备茶多糖铁的研究尚未见报道研究拟以从黑茶中提取的茶多糖为原料，采用静态超高压法制备黑茶多糖铁，并对其制备工艺条件进行优化，探究其体外模拟消化过程中的稳定性和生物可利用性，旨在为黑茶多糖铁的高效制备和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑茶：中茶湖南安化第一茶厂有限公司；

交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-P)、铁标准溶液、胃蛋白酶(14 200 U)、胰酶(USP级)：上海阿拉丁生物科技有限公司；

透析袋：3 500 U，北京索莱宝科技有限公司；

无水乙醇、Na3C6H5O7·2H2O、FeCl3·6H2O、NaOH、HCl、胆盐：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

闪式提取仪：JHBE-20A型，上海钒帜精密设备有限公司；

静态超高压机：5L-HPP600 MPa型，包头科发高压科技有限责任公司；

电子分析天平：BSA224S型，赛多利斯科学仪器有限公司；

冷冻离心机：TGL-16型，四川蜀科仪器有限公司；

恒温水浴锅：HH-4型，国华电器有限公司；

pH计：PB-10型，赛多利斯科学仪器有限公司；

紫外分光光度计：UV-1780型，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑茶多糖提取 将黑茶粉碎，过60目筛。固液比(m黑茶粉∶V溶剂)1∶55 (g/mL)，闪式提取器电压170 V、提取时间107 s；3 500 r/min离心10 min，乙醇沉淀10 h，净水复溶浓缩后冷冻干燥得黑茶粗多糖。取15 g粗多糖溶于300 mL水中，加入3 g PVP-P搅拌10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液重复提取3次，浓缩后于3 500 U透析袋中透析48 h，冷冻干燥得黑茶多糖。

1.3.2 黑茶多糖铁的制备 取0.2 g黑茶多糖溶于10 mL水中，加入0.1 g柠檬酸三钠，用HCl和NaOH调节pH至8；再加入一定量浓度为0.89 mmol/mL的FeCl3溶液，装入塑料袋中密封，置于静态超高压机内腔中，以一定压力处理一定时间后，7 000 r/min离心10 min；收集上清液，加入4倍体积无水乙醇，醇沉1 h，3 500 r/min离心10 min后收集沉淀；沉淀加水复溶后用3 500 U透析袋透析48 h，冷冻干燥得黑茶多糖铁复合物(DTPIC-HP)。

1.3.3 单因素试验

(1) 压力：固定处理时间20 min、糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)2∶1，考察压力(200，300，400，500，600 MPa)对黑茶多糖铁中铁含量的影响。

(2) 处理时间：固定压力400 MPa、糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)2∶1，考察处理时间(10，15，20，25，30 min)对黑茶多糖铁中铁含量的影响。

(3) 糖铁比：固定压力400 MPa、处理时间20 min，考察糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁分别为1∶2，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)对黑茶多糖铁中铁含量的影响。

1.3.4 响应面优化试验 采用Box-benhnken中心组合试验设计，以黑茶多糖铁中铁含量为指标，以压力、处理时间和糖铁比为影响因素，进行三因素三水平响应面优化试验，优化黑茶多糖铁制备工艺。

1.3.5 黑茶多糖铁中铁含量测定 参照Lu等[17]的方法稍作修改。取0.01 g样品溶于50 mL体积分数为0.6%的HCl溶液中；取1 mL待测液置于25 mL具塞试管中，依次加入1 mL体积分数为5%的HCl和1 mL质量分数为10%的盐酸羟胺溶液，室温反应1 h；再加入2 mL质量分数为0.15%的邻菲罗啉和5 mL质量分数为10%的醋酸钠溶液，加入去离子水使溶液总体积为25 mL，室温反应15 min，测定510 nm处吸光值，并采用标准曲线(Y=0.008 4X-0.004 8，R2=0.999 3)计算溶液中铁离子浓度。按式(1)计算铁离子质量分数。

(1)

式中：

y——铁离子质量分数，%；

c——铁离子质量浓度，μg/mL；

v——待测液体积，mL；

m——样品质量，μg。

1.3.6 体外模拟消化

(1) 模拟胃液消化：参照Hu等[18]的方法稍作修改。将2.0 g NaCl和1.6 g胃蛋白酶溶于水中，加入8 mL HCl溶液(1 mol/L)，定容至1 000 mL，用5%的HCl调整溶液pH为2，制得模拟胃消化液。分别称取25 mg DTPIC-HP和7.5 mg FeSO4溶于250 mL胃液中，调节pH为2，37 ℃恒温水浴振荡，每间隔25 min取2.5 mL消化液，并补足相应体积胃液，总反应时间为150 min。将取出的消化液7 000 r/min离心10 min，收集上清液采用邻菲罗啉法测定，并按式(2)计算可溶性铁质量分数。

(2)

式中：

Y——可溶性铁质量分数，%；

F1——消化液中可溶性铁质量浓度，mg/mL；

F2——样品溶解于等量水中的铁质量浓度，mg/mL。

(2) 模拟肠液消化：参照Chen等[19]的方法稍作修改。取1.7 g KH2PO4、0.225 g NaCl、3 g胆盐和1 g胰酶溶于500 mL水中，用0.2 mol/L NaOH调整pH为7.6，制得模拟小肠消化液。分别将样品(25 mg DTPIC-HP和7.5 mg FeSO4)溶于250 mL胃液，置于37 ℃摇床中反应1 h后加入50 mL模拟小肠消化液，调整pH为7.6进行模拟小肠消化。间隔25 min取2.5 mL溶液，并补足相应体积的小肠消化液，总反应时间为150 min。将取出的消化液以7 000 r/min离心10 min，收集上清液采用邻菲罗啉法测定可溶性铁浓度。并按式(2)计算模拟肠液消化的可溶性铁质量分数。

1.4 数据处理

所有试验重复3次。采用SPSS(17.0)软件，采用One-way ANOVA进行方差分析，邓肯法进行事后检验，字母不同表示差异显著(P<0.05)，结果以平均值±标准差表示。采用Excel 2010进行数据误差分析，Prism 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 压力对铁含量的影响 由图1可知，压力对DTPIC-HP中铁含量具有显著性影响。随着压力的增大，DTPIC-HP中铁含量显著升高，当压力为400 MPa时铁含量达到最大。多糖主要通过羟基和羧基与铁离子结合[1]。压力越大，可为螯合反应提供更高的能量，增大了外部干预力[12]，也使多糖的空间构象发生改变，暴露出更多的羟基和羧基，从而增强了多糖与铁离子的结合。酸性多糖与金属离子结合过程中会形成类似“蛋箱”的环形结构，金属离子多被大分子包围[20]。当制备压力过大时，多糖可能被过度降解或“蛋箱”结构被破坏，因此结合铁的能力显著降低。

图1 压力对DTPIC-HP中铁质量分数的影响Figure 1 Effects of pressure on the iron contentin DTPIC-HP

2.1.2 处理时间对铁含量的影响 处理时间过短反应不充分，不利于多糖与铁离子结合。由图2可知，当处理时间为10～20 min时，DTPIC-HP中铁含量随处理时间的增加而升高；继续增加处理时间，铁含量显著降低。说明充分的超高压作用时间是茶多糖与铁离子形成稳定的复合物所必须的；另一方面，长时间超高压处理导致多糖大分子被降解或结构被破坏[20]，限制了结合铁离子的能力。

图2 处理时间对DTPIC-HP中铁质量分数的影响Figure 2 Effects of treatment time on the iron contentin DTPIC-HP

2.1.3 糖铁比对铁含量的影响 由图3可知，糖铁比对DTPIC-HP中铁含量亦有显著影响。随着三氯化铁所占比例的增加，溶液中铁离子浓度增大，增大了铁离子与多糖中羟基等基团的作用机率，因此可增大茶多糖对铁离子的结合率。当溶液中铁离子浓度趋于饱和后，多糖螯合铁离子能力亦达到极限[21]。因此继续增加溶液中三氯化铁的比例，DTPIC-HP中铁含量也不再变化。

图3 糖铁比对DTPIC-HP中铁质量分数的影响Figure 3 Effects of the ratio of polysaccharide to ironon the iron content in DTPIC-HP

2.2 响应面优化

2.2.1 回归模型的建立与方差分析 在单因素试验基础上，以黑茶多糖铁中铁质量分数为指标，以压力、处理时间和糖铁比为影响因素，进行三因素三水平响应面优化试验。试验因素与水平表见表1，试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验设计因素水平

表2 DTPIC-HP的响应面试验设计和结果

由软件可得各因素对黑茶多糖铁中铁质量分数的回归方程为：

y=16.50+0.19A+0.24B-0.74C-0.64AB-0.39AC-0.24BC-0.79A2-0.63B2-1.30C2。

(3)

表3 模型的回归系数和方差分析†

2.2.2 响应面及等高线分析 由图4可知，当压力从200 MPa升高至400 MPa时，铁含量逐渐升高；继续升高压力铁含量则降低。当处理时间从10 min增加至25 min时，铁含量显著升高；进一步增加处理时间铁含量逐渐降低。压力和处理时间接近最优水平时铁含量的变化速率变缓，等高线图呈椭圆形说明压力和处理时间的交互作用对铁含量影响显著(P<0.05)。

图4 压力和处理时间的交互作用对DTPIC-HP铁质量分数的影响Figure 4 Interactive effect of pressure and treatment time on the iron content in DTPIC-HP

由图5可知，当处理时间一定，压力从200 MPa升高至400 MPa时，铁含量快速增加；继续增大压力，铁含量快速降低。当糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)从1∶2升高至2∶1时，铁含量显著升高；进一步增大糖铁比时铁含量明显下降。糖铁比和压力越接近最优水平等高线间距越大，说明铁含量接近峰值的速率变慢；等高线图呈椭圆状，说明糖铁比和压力的交互作用显著(P<0.05)。

图5 压力和糖铁比的交互作用对DTPIC-HP铁质量分数的影响Figure 5 Interactive effect of pressure and the ratio of polysaccharide to iron on the iron content in DTPIC-HP

由图6可知，在压力不变的条件下，当处理时间从10 min增加至25 min时，铁含量显著增加；进一步增加处理时间，铁含量降低。当糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)从1∶2升高至2∶1时，铁含量显著增加；进一步增大糖铁比，铁含量开始降低。由等高线图可知，处理时间和糖铁比具有一定交互作用，但交互作用不显著。

图6 处理时间和糖铁比的交互作用对DTPIC-HP铁质量分数的影响Figure 6 Interactive effect of the treatment time e and the ratio of polysaccharide to ironon the iron content in DTPIC-HP

2.2.3 验证实验 应用Design-Eexpert 8.0.6软件得到黑茶多糖铁的最佳制备工艺为压力424.01 MPa、处理时间21.88 min、糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)1.68∶1.00，此时铁质量分数为16.65%。考虑可操作性，将最佳工艺参数调整为压力425 MPa、处理时间22 min、糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)1.7∶1.0，此条件下制备的铁质量分数平均值为(16.78±0.40)%，与预测值接近，说明优化的超高压制备DTPIC-HP工艺可信。有研究[22]表明，采用传统加热法(38 ℃)进行沙参多糖与三价铁的螯合，所需时间为3 h，铁质量分数为15.61%。也有研究[9]以硫酸化多糖为原料，与三价铁在50 ℃下反应4 h制备硫酸化多糖铁，其铁质量分数为8.95%。综上，试验优化的静态超高压制备黑茶多糖铁工艺具有高效、复合物中铁结合率高的优势。

2.3 体外模拟消化

铁在机体中主要的吸收部位为小肠[23]。通常口服补铁剂进入小肠前会在胃中被胃酸和酶水解，部分铁离子被释放，其进入小肠后溶解度降低，很难被小肠上皮细胞吸收从而降低了生物利用度[17，24]。因此，对铁补充剂在胃、肠消化液中可溶性铁含量的评估是判断其生物利用度的一个重要方法。

由图7(a)可知，随着反应时间的增加，DTPIC-HP和FeSO4中的可溶性铁质量分数均出现不同程度的增长，当反应时间为25 min时，DTPIC-HP中的可溶性铁质量分数为84.41%，FeSO4中的可溶性铁质量分数仅为19.27%；继续反应至50 min，二者可溶性铁含量趋于最大值，其中DTPIC-HP中的铁几乎完全可溶，而FeSO4中可溶性铁质量分数为77.98%。

由图7(b)可知，反应初始25 min，DTPIC-HP和FeSO4中的可溶性铁质量分数先快速下降后趋于平稳。当反应时间为25 min时，DTPIC-HP和FeSO4中的可溶性铁质量分数分别为81.22%，18.27%；反应结束时，DTPIC-HP中的可溶性铁质量分数为86.82%，而FeSO4中的可溶性铁质量分数仅为16.78%。

图7 DTPIC-HP和FeSO4体外模拟消化试验对比Figure 7 Comparison of the simulated digestion experiment in vitro for DTPIC-HP and FeSO4

综上，经胃、肠液消化后DTPIC-HP中的可溶性铁含量明显高于FeSO4中的。这是因为FeSO4在生理pH(4.5～8.5)条件下易生成氢氧化铁沉淀[25]，且其主要在肠液消化阶段快速形成沉淀。而DTPIC-HP中仅有部分铁在胃液中被水解，在肠液中只有少量铁不溶解；另一方面，由于缓释作用，使得DTPIC-HP在肠液中反应至75 min时释放出更多的可溶性铁。DTPIC-HP在胃、肠液中可溶性铁含量较高的原因可能是其分子量较高，不易被胃、肠液水解，因此具有更高的生物利用度。因此，相比传统加热法制备的多糖铁，静态超高压制备的黑茶多糖铁的生物利用率更好。

3 结论

试验表明，静态超高压可显著增强黑茶多糖与铁离子的螯合，且溶液中足够的铁离子浓度和充足的处理时间是黑茶多糖铁制备所必须的条件；但是过高的压力和过长的处理时间均不利于黑茶多糖铁的形成。各因素对黑茶多糖铁中铁含量影响的大小顺序为糖铁比>处理时间>压力。响应面优化的最佳静态超高压工艺条件为糖铁比(m黑茶多糖∶m三氯化铁)1.7∶1.0，压力425 MPa，处理时间22 min，此时黑茶多糖铁中铁质量分数为16.78%。黑茶多糖铁在体外模拟胃、肠液消化过程中均表现出良好的稳定性，至消化结束可溶性铁质量分数为86.82%，其生物利用率明显高于无机铁补充剂FeSO4。黑茶多糖铁在体内的消化利用还有待进一步研究。