不同炮制山茱萸入方的六味地黄汤对去卵巢大鼠股骨OPG/RANK/RANKL基因表达的干预作用及机理

雷欣东，杨磊，朱付平，易建，于慧，龙琼，李俊威，黄莉，肖望重，戴冰*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是女性绝经期后由于卵巢功能降低、雌激素分泌水平下降所引起的骨质疏松症［1］。主要表现为单位体积内骨量减少、骨组织显微结构退化、骨密度下降及骨强度减弱，导致骨脆性增高，骨折危险性增加。其发病机制与雌激素水平降低导致的骨代谢失衡，即成骨细胞的骨形成能力与破骨细胞的骨吸收能力失衡有关［2］。研究发现，护骨素（Osteoprotegerin recombinant protein，OPG）/NF－κB 受体活化因子（Receptor Activator for Nuclear Factor－κB，RANK）/NF－κB 受体活化因子配体（Receptor Activator for Nuclear Factor－κB Ligand，RANKL）系统在调节骨代谢中起关键作用［3］。探讨该系统与PMOP 发病的关系是近年来PMOP 研究的热点问题。

目前对该病的治疗主要以雌激素、钙剂和双膦酸盐类药物，如阿仑膦酸钠等为主，虽有较好的临床疗效，但由于其副作用较大，在一定程度上限制了推广与长期应用。因此，疗效确切、不良反应少的中药越来越受到临床使用的重视。中医学认为，肾藏精，为先天之本，主骨生髓。因此，以“骨痛、骨痿不用”为主要表现的绝经后骨质疏松症，多用补肾法主治之。

六味地黄丸是宋·钱乙《小儿药证直诀》中记载的补肾方剂，全方以熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓六药为末，炼蜜丸制成。由于其组方严谨，临床疗效确切，成为治疗以腰膝酸软、头晕耳鸣等为主要表现的肾阴虚证的经典方剂，也是临床用治PMOP 的常用方剂。大量实验、临床研究均证实该方对PMOP 具有较好疗效，然其作用机制具体为何，目前尚未能完全阐释清楚。因此，需要开展相关研究探讨六味地黄汤改善PMOP的具体机制。

本课题组前期采用不同炮制山茱萸配伍入方制成六味地黄汤，比较研究了不同炮制山茱萸入药的六味地黄汤（不同组六味地黄汤）对去卵巢模型大鼠的作用差异，并从骨代谢指标的层面探讨了其作用机理［4］。发现不同组六味地黄汤均可通过调节反映成骨细胞与破骨细胞活性的骨代谢指标，提高模型大鼠骨密度水平，从而改善绝经后骨质疏松症。这是否与六味地黄汤可通过调控模型大鼠OPG/RANK/RANKL 系统有关？若有关，不同炮制山茱萸入方的六味地黄汤对该系统的调控能力是否有差异？为解决上述问题，本研究拟在前研究的基础上，采用RT－qPCR 技术，探讨不同组六味地黄汤对模型大鼠股骨OPG、RANK、RANKL mRNA 表达水平的影响，进一步探究不同组六味地黄汤干预绝经后骨质疏松症的作用差异及其机理，为临床选择更优的炮制品山茱萸配伍入六味地黄方提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雌性6月龄SD大鼠70只，许可证号：SYXK（湘）2015－0003，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物实验严格遵守湖南中医药大学实验动物伦理委员会指导原则。于湖南中医药大学实验动物中心饲养，饲养条件：室温20～22 ℃，湿度50%～55%。

1.2 主要药物与汤剂制备

阿仑膦酸钠片（Alendronate Sodium Tablet，批号：1704004，云南万裕药业有限公司，规格：10 mg）；六味地黄汤按原方比例（熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）称取各味药材饮片，方中除山茱萸外，饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科；不同炮制山茱萸以前期研究发现的最优炮制工艺制成［4］：生品山茱萸（生茱萸）、酒制山茱萸（酒茱萸）、蒸制山茱萸（蒸茱萸）、盐制山茱萸（盐茱萸）。

六味地黄汤煎煮方法为：原药材加6 倍量水，煎煮2 次，过滤，合并2 次药液后浓缩至1.5 g/mL。再按比例分别称取不同炮制品山茱萸配伍入方，操作同上，均制得生药含量为1.5 g/mL 的浓缩液，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂

雌二醇放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所有限公司，批号：180820）；RT－qPCR 用试剂盒：总RNA 提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，批号：DP419，规格：50 次］；NovoScript Plus All－inone 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix（Gdna Purge）（批号：0516971，规格：50 次）；NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus（批号：0514771，规格：50次）。

1.4 主要仪器

DAD 经济节能型蒸柜；超高速冷冻离心机（德国HERMLE Labor－technik GmbH，型号：Z36HK，离心半径17.5 cm）。

1.5 分组

将所有大鼠随机分为7组：空白组、模型组、阿仑膦酸钠对照组（阳性药物组），以及不同炮制山茱萸分别配伍入方的六味地黄汤生茱萸组（生茱萸组）、六味地黄汤酒茱萸组（酒茱萸组）、六味地黄汤盐茱萸组（盐茱萸组）和六味地黄汤蒸茱萸组（蒸茱萸组），每组10只。

1.6 造模

除空白组外，所有雌性SD 大鼠适应性饲养1 周后，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛溶液（给药剂量3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。于腹部正中偏下处备皮，碘伏消毒，从腹正中线做一处纵行切口，打开腹壁，在腹腔脂肪中顺着输卵管分离出菜花样卵巢组织，结扎后剪去双侧卵巢，逐层缝合切口，生理盐水洗净血迹。术后大鼠均肌肉注射20万U青霉素预防感染。

1.7 给药与取材

术后第5 天开始对大鼠进行灌胃给药，其中空白组、模型组大鼠以10 mL/kg剂量给予0.9%生理盐水灌胃，酒茱萸组、盐茱萸组、蒸茱萸组和生茱萸组以6.75 g/kg 剂量给予相应六味地黄汤灌胃，阳性药物组以6.3 mg/kg剂量给予阿仑膦酸钠灌胃，每日1次，连续14周。给药后每周测量1次体质量，根据体质量变化调整药量。

给药第14 周末，所有大鼠禁食24 h 后麻醉，先行腹主动脉采血，再取大鼠两侧股骨。所得血液静置后以3 500 r/min 离心15 min，取血清置于－20 ℃冰箱保存。股骨剥离肌肉组织后，用湿纱布包裹，置于冻存管中。每组取2 只大鼠左侧股骨头，用4%多聚甲醛固定，其余股骨于－80 ℃冰箱保存以备后用。

1.8 检测指标

1.8.1 血清雌二醇（E2）水平

由湖南中医药大学第一附属医院同位素室采用放免法检测。

1.8.2 股骨头组织病理学观察

取出左侧股骨头，4%多聚甲醛固定72 h 后，再用10%EDTA 脱钙液脱钙，脱钙液每3 d 换1 次。脱钙完成后，用PBS冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，次日进行石蜡包埋，切片厚度为2～4 μm，常规HE 染色。光镜下观察大鼠股骨头组织病理学改变。

1.8.3 股骨中OPG、RANK、RANKL 的mRNA 表达水平测定

于－80 ℃冰箱取出冻存的股骨，液氮下研磨成粉，按Trizol 试剂盒说明提取总RNA，逆转录合成cDNA，以β－actin 作为内参照。各基因引物序列由北京擎科生物科技有限公司设计合成，序列见表1。RT－qPCR扩增体系为20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Hot Star Taq Master Mix（2×）10 μL，加RNase－free dd H2O至20 μL。扩增程序为：预变性94 ℃5 min；变性94 ℃45 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃1 min，共40 个循环，后于72 ℃延伸10 min。扩增反应在ABI7500实时荧光PCR 系统上执行。运用2－ΔΔCt方法，比较各组OPG、RANK、RANKL的mRNA水平相对表达量。

表1 各基因引物序列

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件处理实验数据，所有数据用均数± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD 法，若不满足正态性，则用非参数检验，P< 0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

大鼠喂养过程中，部分组出现死亡现象，去除离群值后，每组计入统计数量的大鼠均为7只。

2.2 各组大鼠体质量情况

与空白组比较，模型组大鼠体质量有统计学意义（P<0.01），提示在连续喂养14周后，去卵巢大鼠体质量上升明显。与模型组比较，酒茱萸组、生茱萸组、盐茱萸组、蒸茱萸组大鼠体质量均有统计学意义（P<0.05），提示不同山茱萸入方的六味地黄汤均可以抑制去卵巢后引起的体质量迅速增长，且其效果优于阳性药物组。见表2。

表2 各组大鼠体质量情况比较（±s，n=7）

表2 各组大鼠体质量情况比较（±s，n=7）

注：与空白组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

组别空白组模型组酒茱萸组盐茱萸组蒸茱萸组生茱萸组阳性药物组组别空白组模型组酒茱萸组盐茱萸组蒸茱萸组生茱萸组阳性药物组第7周358.07±23.39 387.50±29.46 363.31±23.40 360.62±51.26 362.29±40.00 378.57±39.52 395.83±37.66第14周374.40±21.22 431.43±58.81△△381.60±37.47*386.96±37.49*386.14±34.11*387.08±21.29*400.21±47.62第1周333.22±27.02 333.18±29.46 361.37±18.70 352.18±19.78 334.30±27.01 360.37±18.70 348.66±30.39第8周366.83±20.04 385.14±53.74 366.94±26.42 364.24±45.32 354.80±33.63 375.22±38.61 396.76±40.36第2周350.83±20.67 364.40±36.33 358.47±21.35 358.68±28.93 352.81±33.30 362.05±24.66 366.49±23.09第9周381.33±20.53 392.76±62.47 376.07±31.30 385.18±36.91 364.87±33.21 383.92±41.85 406.86±39.30第3周355.18±22.40 363.18±37.07 370.19±29.70 364.08±46.99 358.57±38.09 363.77±30.52 363.44±28.02第10周373.98±22.88 395.95±62.23 378.83±26.76 381.04±37.06 366.40±31.80 381.77±41.11 392.77±37.63第4周350.05±21.96 369.33±37.84 362.69±29.92 354.44±46.20 373.77±43.87 362.68±38.65 373.01±29.53第11周359.97±22.79 399.20±61.77 375.71±36.15 376.68±37.47 363.57±30.35 384.23±36.04 400.69±35.69第5周342.65±38.74 367.64±40.86 367.31±33.70 344.26±54.47 351.19±43.88 370.55±41.85 382.27±33.57第12周363.78±24.66 410.54±60.99△377.66±38.61 376.98±40.48 375.86±33.08 387.07±27.28 400.31±39.50第6周336.87±55.96 376.20±43.84 364.96±25.90 357.00±51.07 351.24±37.55 373.92±36.31 393.89±34.38第13周365.88±30.88 425.93±56.45△367.84±36.81 384.22±42.82 379.71±33.06 391.88±24.05 394.87±43.60

2.3 各组大鼠股骨头组织形态学情况

与空白组比较，模型组骨小梁变薄，出现断裂，骨板走形凌乱；骨髓腔出现大量空泡，提示脂肪组织增多，红骨髓变为黄骨髓，造血功能下降。与模型组比较，酒茱萸组、蒸茱萸组骨小梁增厚增粗，断裂处明显减少；骨髓腔脂肪空泡明显减少，骨髓含量增加；骨小梁骨板走形较为均匀。而盐茱萸组、生茱萸组骨小梁断裂的情况虽得到一定的改善，但脂肪空泡并未明显改善，效果较酒茱萸组、蒸茱萸组差。见图1。

图1 各组大鼠股骨头组织形态学情况（HE染色，×200）

2.4 各组大鼠血清E2水平比较

与空白组比较，模型组大鼠血清E2水平有统计学意义（P<0.01），提示大鼠去卵巢后，血清E2水平会显著降低。与模型组比较，酒茱萸组、生茱萸组、蒸茱萸组模型大鼠血清E2水平均有统计学意义（P< 0.05），提示酒茱萸、生茱萸、蒸茱萸入药的六味地黄汤均可显著改善去卵巢导致的大鼠血清雌二醇降低。见表3。

表3 各组大鼠血清E2水平比较（±s，pg/mL）

表3 各组大鼠血清E2水平比较（±s，pg/mL）

注：与空白组比较，△P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05，**P <0.01。

组别空白组模型组生茱萸组酒茱萸组盐茱萸组蒸茱萸组阳性药物组n7 7 7 7 7 7 7 E2 7.78±2.61 3.02±1.67△5.90±2.38*6.53±1.73**5.12±1.81 5.90±1.44*5.80±1.22*

2.5 各组大鼠股骨OPG、RANK、RANKL mRNA 表达水平比较

与空白组比较，模型组大鼠股骨OPG、RANKL 的mRNA 表达具有统计学意义（P< 0.05，P< 0.01），提示去卵巢后，大鼠股骨OPG mRNA 表达明显下降，RANKL mRNA 明显上升，而不同组六味地黄汤均可显著降低RANKL mRNA 表达（P< 0.01）。不同组六味地黄汤虽均可提高模型大鼠股骨OPG mRNA 表达，但组间比较并无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 各组大鼠股骨OPG、RANK、RANKL的mRNA表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠股骨OPG、RANK、RANKL的mRNA表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，△P < 0.05，△△P < 0.01；与模型组比较，**P <0.01。

RANKL 1 3.12±1.65△△0.59±0.62**0.81±0.24**0.89±0.23**1.24±0.68**0.83±0.65**组别空白组模型组酒茱萸组盐茱萸组蒸茱萸组生茱萸组阳性药物组n7 7 7 7 7 7 7 OPG 1 0.24±0.33△0.77±0.74 0.71±0.45 0.96±0.86 0.93±0.93 0.75±0.27 RANK 1 0.91±0.54 0.34±0.27△1.13±0.94 0.95±0.32 0.49±0.50 0.62±0.34

3 讨论

卵巢是雌激素分泌的主要来源场所，本研究显示模型组大鼠在切除双侧卵巢后，血清雌激素水平显著降低，股骨头病理切片显示骨小梁断裂明显，出现大量脂肪空泡，表明造模较好地达到了预期效果，去卵巢绝经后骨质疏松症大鼠模型建立成功。

本实验发现，酒茱萸组、蒸茱萸组、生茱萸组均可以显著提高模型大鼠血清E2水平，而盐茱萸组的效果偏弱。这可能与六味地黄汤的补肾作用有关，中医学中“肾”作为五脏之一，其实质是涵盖生殖、神经、内分泌等多方面的综合系统。现代研究发现，肾虚证的调控位置可能在下丘脑，经过下丘脑－垂体－靶腺轴影响人体的生命活力［5］，而绝经后妇女卵巢几乎不产生性激素，此时体内的雌激素主要是由肾上腺所分泌合成的脱氢表雄酮（DHEA）在外周组织如骨、脂肪、肝脏等处，由特定的酶催化转化而来［6］。大量实验研究与临床研究均证实六味地黄汤具有调控雌激素及其受体的药理作用［7］，因此，笔者推测六味地黄汤调节模型大鼠血清雌激素水平的机制或与其可通过调控下丘脑－垂体－肾上腺轴，影响去卵巢后的大鼠雌激素转化速率有关，然该推测的证明还需进一步研究实现。另一方面，从股骨头病理切片看，不同组六味地黄汤均可以改善骨小梁断裂，减少脂肪空泡。但酒茱萸组、蒸茱萸组效果优于盐茱萸组与生茱萸组。

山茱萸盐制可促进药物入肾经，然而在本实验中发现，盐茱萸入方的六味地黄汤对血清E2的改善作用较差，笔者认为这可能与多种原因有关。一方面，有研究表明山茱萸酒制和蒸制可使其多糖成分明显增加，盐制则不利于多糖的浸出［8］。而山茱萸多糖有一定的抗衰老与生殖保护作用，可以显著提升衰老雌性大鼠雌激素水平［9］。因此，盐茱萸多糖成分较其他制品山茱萸低或许是该情况出现的原因之一。另一方面，也不排除山茱萸盐制工艺区别、实验操作技术失误等多方面因素从而导致结果出现偏差。

肥胖也是影响绝经后骨质疏松症发生的因素之一，随着脂肪含量增加，肌肉含量与骨矿盐含量减少，导致骨密度减少［10－11］。本实验发现，大鼠在去卵巢后，雌激素水平下降，骨质发生流失，同时体质量也持续性增加，在连续喂养14 周后，与空白组大鼠比较，体质量有显著性差异，符合肥胖与绝经后骨质疏松症的关联性，其机理可能与六味地黄汤可提高模型大鼠血清雌激素水平，纠正去卵巢后的脂代谢紊乱，抑制去卵巢后持续体质量增长导致的肥胖，增加肌肉与骨矿盐含量，提高骨密度，从而改善绝经后骨质疏松症有关。酒茱萸组、蒸茱萸组、盐茱萸组和生茱萸组均可以显著抑制大鼠去卵巢后的体质量增长，且组间差距并不明显。

一般情况下，骨刺激因子会先与成骨细胞发生信息传递，使其分泌包括RANKL 在内的一系列细胞因子［12］。RANKL 与破骨细胞表面受体RANK 结合后，可促进破骨细胞分化成熟，加速骨吸收［13］。而OPG 是RANKL 的诱饵样受体，可竞争性结合RANKL，阻断RANKL 与RANK 的相互作用，抑制破骨细胞分化成熟，从而调节骨代谢。女性绝经后雌激素水平降低，OPG 分泌减少，RANKL 水平上升，破骨细胞活性增加。骨吸收加速，导致骨质流失，引发绝经后骨质疏松［14］。本研究显示，不同组六味地黄汤均可提高模型大鼠股骨OPG mRNA 表达，降低RANKL mRNA 表达，使OPG/RANKL 比值上升，RANKL 与RANK 的结合减少，从而抑制破骨细胞的分化与成熟，使骨吸收水平下降，改善绝经后骨质疏松症，这可能是六味地黄汤改善绝经后骨质疏松症的重要机制之一。其中，不同组六味地黄汤提高OPG mRNA 表达的效果相似，没有显著性差异，而生茱萸组抑制RANKL mRNA 表达的效果稍弱于酒茱萸组、盐茱萸组、蒸茱萸组。这表明酒制、盐制、清蒸制、生品山茱萸入药的六味地黄汤均可以通过调控股骨OPG、RANK、RANKL mRNA 表达，抑制过度激活的破骨细胞活性，修复断裂的骨小梁，提高骨密度水平，从而改善绝经后骨质疏松症，且不同组六味地黄汤的效果没有统计学意义，但酒制品、清蒸制品山茱萸入药的六味地黄汤效果更佳，临床可以根据具体情况，酌情选择合适的炮制品山茱萸入方。这一研究可为2020 版《中华人民共和国药典》规定六味地黄丸中采用酒茱萸入方提供实验数据支持。