新风胶囊联合黄芩清热除痹胶囊改善类风湿关节炎湿热痹阻证患者感受的关联规则分析

王杰，刘健，文建庭，王馨，忻凌，方妍妍，葛瑶

安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科，合肥 230031

类风湿关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病[1]，临床主要出现关节滑膜炎症等[2]，严重影响患者生活质量和社会功能[3-4]。RA归属于中医学“痹证”范畴[5]，以湿热痹阻证居多，主要临床表现为关节肿痛而热，屈伸不利；发热、口渴、不欲饮、烦闷不安、小便黄；舌质红，苔黄腻；脉滑数或弦滑等[6]。炎症免疫反应是RA发病的主要病因[7]，患者感受(SPP)是评价RA结局的重要指标，RA炎症免疫反应会导致SPP降低，严重影响患者生活质量。新风胶囊(Xinfeng caspule，XFC)与黄芩清热除痹胶囊(Huangqin qingrechubi capsule，HQC)同为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，临床治疗RA湿热痹阻证常采用健脾清热通络法XFC联合HQC，可以共同发挥清热利湿、健脾通络作用[8]。本文旨在通过关联规则与动物实验相结合，探究XFC联合HQC如何改善RA湿热痹阻证患者SPP及免疫炎症反应，为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 病历资料与方法

1.1.1 临床资料 回顾性分析2019年2月至2020年12月在安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院的208例RA湿热痹阻证住院患者病历资料，其中男性40例，女性168例；年龄(56.5±12.9)岁；病程(15.3±9.1)年。本研究通过安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会审查(伦理编号：2019AH-12)。

1.1.2 诊断及纳排标准

1.1.2.1 诊断标准 所有患者均符合2010年美国风湿病学会(ACR)联合欧洲抗风湿病联盟(EULAR)提出的RA诊断标准[9]；RA湿热痹阻证中医辨证论治方案参照2018年类风湿关节炎病证结合诊疗指南[10]。

1.1.2.2 纳入标准 符合上述中西医诊断；均签署知情同意书；治疗前后SPP量表、实验室指标完善；住院期间均给予中医药治疗：XFC(由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤组成)、HQC(由黄芩、栀子、薏苡仁、威灵仙等组成)：每粒含生药0.4 g，专利号：ZL201310011369.8、ZL201110095718.X；再加中医辨证论治[10]每日1剂，均以4周为1个疗程。药物由安徽中医药大学第一附属医院中药房和制剂室提供。

1.1.2.3 排除标准 关节严重畸形，完全丧失关节功能者；合并有心、肝、肾等严重疾病以及严重关节外表现；妊娠或哺乳期妇女；肿瘤性疾病；观察期间应用免疫抑制剂和生物制剂的患者。

1.1.3 观察指标

1.1.3.1 SPP量表 湿热痹阻证候积分量表；脾虚湿盛证候积分量表；28个关节的疾病活动度(DAS28)评分；视觉模拟评分量表(VAS)；焦虑自评量表(SAS)、抑郁自评量表(SDS)；健康调查简表(SF-36)。

1.1.3.2 实验室指标 红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(CCP-AB)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3、补体C4。

1.1.4 关联规则分析 治疗前各指标、评分在正常值范围内取值定为“0”，低于或高于正常值范围取值定为“1”；治疗后改善取值定为“1”，不变或加重定为“0”。设最小支持度为70%，最小置信度为80%，最小提升度为1，采用SPSS Clementine 12.0中的 Aprior 模块挖掘中药与SPP评分、实验室指标间的关联性[11]。

1.1.5 Spearman相关性分析 采用Spearman相关性分析分析RA湿热痹阻证患者SPP与免疫炎症指标之间关系。检验标准为P<0.05。

1.2 动物实验与方法

1.2.1 实验动物 30只雄性SD大鼠，购自安徽省实验动物中心，喂养于保持室内环境安静的动物房，维持温度湿度稳定。

1.2.2 药品与试剂

1.2.2.1 药品 XFC：黄芪476 g、薏仁米476 g、雷公藤238 g、蜈蚣24条；HQC：黄芩60 g、薏苡仁180 g、桃仁30 g、栀子54 g、威灵仙60 g；两药制作均为按比例加75%乙醇回流提取，药渣再经水煎煮、滤过、静置，取上清液同醇提液合并减压浓缩收膏，最后加入糊精制成整粒；由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；弗氏完全佐剂(Sigma公司)。

1.2.2.2 试剂 戊巴比妥购自上海雅吉生物科技有限公司；CRP(SU-B30078)、RF(SU-B30575)、白细胞介素1β(IL-1β)(SU-B37304)、白细胞介素6(IL-6)(SU-B30201)、白细胞介素10(IL-10)(SU-B30217)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(SU-B30274)购自泉州市睿信生物科技有限公司。

1.2.3 造模及给药 将大鼠按照随机数字表法分为正常组(NC)10只，模型组(MC)10只，XFC+HQC组10只；适应性饲养1周后。MC组与XFC+HQC组每只大鼠于右后足趾皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL，并放置于湿度90%，温度：36～38 ℃，风速：5 m/s的气候箱中，每日2次，每次2 h，连续14 d[12]。

造模后第15天进行给药，NC组和MC组：0.9%氯化钠(NaCl)，1 mL/100 g；XFC+HQC组：将XFC和HQC去除胶囊壳研磨成粉状，加0.9%NaCl配成混悬液(每毫升含药量0.068 g，1 mL/100 g灌胃30 d。

1.2.4 观察指标 分别在大鼠造模前1天、给药前1天、给药后第30天，观察各组大鼠的体质量(W)、足跖肿胀度(E)和关节炎指数(AI)。使用电子天平称重大鼠W；按公式[13](给药前肿胀度=Vt1-Vn1/Vn1×100%；给药后肿胀度=Vt2-Vn2/Vn2×100%)测算大鼠E；按标准[14]测算大鼠AI：0分，无红肿；1分，小趾关节红肿；2分，趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下足爪肿胀。收集大鼠腹主动脉血，以3 000 r/min转速离心15 min提取血清，ELISA法测定大鼠血清炎症和细胞因子表达量。

2 结果

2.1 RA湿热痹阻证SPP及临床指标变化 与治疗前相比，RA湿热痹阻证患者湿热痹阻证候积分、脾虚湿盛证候积分、DAS28、VAS、SAS、SDS均显著改善(P<0.05)，ESR、CRP、CCP-AB、RF、IgG均显著下降(P<0.05)，IgA、IgM、C3、C4变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 RA湿热痹阻证患者SPP及临床指标的变化

2.2 RA湿热痹阻证SPP与临床指标相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，RA湿热痹阻证患者DAS28评分与RF呈正相关(P<0.05)，湿热痹阻证候积分与IgA、IgG、CCP-AB、脾虚湿盛证候积分呈正相关(P<0.05)；SAS评分与ESR、RF、C3呈正相关(P<0.05)，见图1。

注：RF为类风湿因子，DAS28为28个关节的疾病活动度评分，IgA为免疫球蛋白A，IgG为免疫球蛋白G，CCP-AB为抗环瓜氨酸肽抗体，ESR为红细胞沉降率，SAS为焦虑自评量表，C3为补体C3，RA为类风湿关节炎；SPP为患者感受。

2.3 XFC联合HQC与SPP、实验室指标改善的关联规则分析 关联规则结果显示，XFC+HQC对SPP、实验室指标改善的支持度均大于70%，置信度均大于80%，提升度均大于1，有较强关联度，见表2。

表2 XFC联合HQC治疗与SPP、实验室指标改善的关联规则分析

2.4 XFC联合HQC对AA湿热痹阻证大鼠W、E和AI的影响 造模前，NC组、MC组、XFC+HQC组大鼠足趾肿胀程度无差异；造模后，大鼠足趾出现肿胀，肤色发红紧绷并有热感；XFC+HQC给药后，大鼠足趾肿胀程度降低，肤色相对较白，局部皮温恢复正常，见图2。

图2 各组大鼠足跖趾关节肿胀程度比较

与NC组相比，MC组大鼠W显著下降，E和AI显著升高(P<0.05)；经XFC联合HQC治疗后，大鼠W显著升高，E和AI显著下降(P<0.05)，见图3。

2.5 XFC联合HQC对AA湿热痹阻证大鼠CRP、RF和细胞因子的影响 与NC组相比，AA湿热痹阻证组RF、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α表达升高(P<0.05)，IL-10表达显著下降；经XFC联合HQC治疗后，RF、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低，IL-10表达显著上升(P<0.05)，见图4。

3 讨论

RA以对称性多关节炎为主要临床表现，严重影响患者的生活质量[15]，SPP量表是评价包括RA在内的关节炎患者结局的重要标准。本团队前期已研究表明，RA患者SPP与疾病活动性指标ESR、RF、CRP、IgG等密切相关，提示RA疾病活动度越高，SPP越差[16]。临床上针对RA湿热痹阻证常采用病证结合治疗——新安健脾通痹系列方XFC联合HQC。为了探究XFC联合HQC对RA湿热痹阻证SPP及免疫炎症的干预作用，本研究对208例RA湿热痹阻证患者进行回顾性分析，通过相关性分析研究SPP与临床免疫炎症指标之间的关系，关联规则分析XFC联合HQC与RA湿热痹阻证SPP、炎症指标改善的关联度。此外，为了进一步从体内探究XFC联合HQC对RA湿热痹阻证SPP、免疫炎症的影响，本研究建立AA湿热证大鼠模型，并予以XFC联合HQC灌胃，通过对W、E、AI变化观察，类比RA患者SPP变化，并检测AA湿热证大鼠体内炎症指标变化，从动物实验角度补充说明健脾清热通络法XFC联合HQC的疗效。

孙玥等[16]通过选取604例RA患者及60例健康人对照分析发现RA患者普遍存在焦虑抑郁等情志障碍，且SDS、SAS与免疫炎症指标存在显著相关性。本研究发现RA湿热痹阻证SPP与免疫炎症指标也显著升高，且SPP与免疫炎症指标也呈显著正相关；孙艳秋等[17]通过对1 251例RA患者数据挖掘发现健脾化湿通络法可有效调节RA患者免疫反应、抑制炎症反应等，本研究关联规则表明，XFC+HQC与SPP、实验室指标的改善有显著关联；周丹丹等[18]通过XFC含药血清干预AA大鼠发现与健康对照组相比，AA组大鼠IL-17、IL-21表达显著升高，IL-10显著降低，XFC组大鼠细胞因子IL-17、IL-21表达显著降低，IL-10表达显著升高，这与本研究结果相近，AA湿热痹阻证大鼠W、IL-10显著下降，E、AI、CRP、RF、IL-1β、IL-6、TNF-α显著升高，经XFC+HQC干预后，各指标均有改善。

XFC具有健脾化湿通络作用，方中黄芪、薏苡仁为君药。其中黄芪甲苷可以通过调控JNK信号通路相关细胞因子表达抑制TNF-α诱导的RA滑膜成纤维细胞增殖[19]。动物实验表明[20]薏苡仁蛋白和薏苡仁挥发油对AA大鼠具有显著效果，可以减轻大鼠关节红肿的症状，减轻E，降低大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6的含量。有研究表明[21]XFC通过下调促炎因子，上调抑炎因子，改善患者免疫炎症反应。HQC具有清热除痹、健脾化湿功用，方中黄芩、栀子为君药。研究表明[22]黄芩素可减轻RA患者外周血单个核细胞炎症反应；实验研究[23]栀子苷可升高IL-10表达，降低IL-17。研究发现[24]HQC明显改善RA患者临床症状和炎症，其疗效优于来氟米特。数据挖掘发现XFC联合HQC能够有效改善类风湿关节炎湿热证患者的异常免疫炎症指标[25]。

综上所述，本研究通过RA湿热痹阻证患者临床数据分析结合AA湿热证大鼠实验，表明了XFC联合HQC可以显著改善患者SPP，提高生活质量，改善RA湿热痹阻证患者免疫炎症反应等，也可调控AA湿热证大鼠的关节症状和炎症水平。为XFC联合HQC在临床的应用上提供依据和指导作用，下一步本团队将从生物分子学角度探究分析XFC联合HQC对RA湿热痹阻证患者的治疗作用。

注：MC组与NC组比较，*P<0.05，** P<0.01；XFC+HQC组与MC组比较，#P<0.05， ##P<0.01。

注：RF为类风湿因子，CRP为C反应蛋白，IL-10为白细胞介素10，IL-1β为白细胞介素1β，IL-6为白细胞介素6，TNF-α为肿瘤坏死因子α；MC组与NC组比较，***P<0.001；XFC+HQC组与MC组比较， ##P<0.01，###P<0.001。