基于标准汤剂对化湿止咳汤质量标准的研究

辛加敏 阮婧华 范东生 苏松柏 万明香 查 鑫 史耀辉 夏 青

贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001

随着中医药现代化的发展，中药从原有的汤剂、膏、丹、丸、散等剂型到现有的片剂、胶囊剂、颗粒剂等[1]，汤剂都扮演着重要的角色，在疾病预防、治疗、诊断，都有着广泛的临床应用，在慢性疾病的治疗过程中，有着举足轻重的地位。此外，汤剂由于廉价、易得、煎煮方便等优点，是患者常选的剂型之一。

但是，汤剂在大量使用时，特别是常用处方，缺乏质量控制标准，易造成疗效降低等情况[2]。因此，对使用量大的处方设定一定的参数如出膏率、pH、含量测定等进行评价的研究，对汤剂的发展有着重要意义。化湿止咳汤源于玉屏风散和藿香正气散两个古方加减而成，主要由广藿香、山药、白术、法半夏、炙甘草、炒紫苏子六味中药组成[3]，该方煎煮后散发清香之味，治疗湿证效果较佳，患者服用顺应性好，受广大患者欢迎。在保证安全性及疗效的前提下，将其研究成为医疗机构制剂，不仅给患者使用带来方便，还降低患者用药成本。

目前，医疗机构制剂质量控制主要采用薄层鉴别、单一指标成分定量等，该类方法缺乏中医药整体性的特点。“标准汤剂”是在中医药理论指导下，按照临床汤剂煎煮方法，采用适当方法制得，可作为制剂与临床汤剂标准参照物[4]。因此，为建立化湿止咳汤的特征性质量标准，本研究遵循原始汤剂特点，参照标准汤剂研究方法，通过对汤剂的pH、出膏率、指标成分定性定量、指纹图谱研究，为该制剂的质量控制提供可靠方法，保证与传统汤剂的一致性。使煎煮后的汤剂更加合理、规范、科学、从而发挥更好的疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695型高效液相(美国waters公司)；MS105DU十万分之一的电子分析天平(美国METTLER TOLEDO)；Milli-Q纯水机(法国默克)，电热套(天津泰斯特仪器有限公司)；超声机(昆山市超声仪器有限公司)；pH测定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2 试药与材料 甘草苷(批号：111610-201908)购买于中国食品药品检定研究院，广藿香和炒紫苏子(贵阳同仁堂)；山药、白术、法半夏(四川千方药业)；炙甘草(四川博仁药业)，经我院陈秀敏主任药师鉴定均为正品，研究样品山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaOppositaThunb.的干燥根茎山药；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizaUralensisFisch、胀果甘草GlycyrrhizaInflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根炮制品；半夏为天南星科植物半夏PinelliaTernata(Thunb.)Breit.的干燥块茎的炮制品；紫苏子为唇形科植物紫苏PerlaalFrutescens(L.)Britt.的干燥成熟果实；广藿香为唇形科植物广藿香PogostemonCablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分；白术为菊科植物白术AtractylodesMacrocephalaKoidz.的干燥根茎。

1.3 化湿止咳汤剂的制备 根据国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》，按化湿止咳汤处方分别称取各味药材共15批，第一次加水180 mL，浸泡30 min，煎煮20 min；第二次加水140 mL，煎煮20 min，合并煎液，即得。

2 方法与结果

2.1 出膏率及pH测定 分别精密吸取15批化湿止咳汤20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，按照《中国药典》2015版，置已恒重的蒸发皿中，于105 ℃干燥3 h，移置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，得出15批化湿止咳汤出膏率在15.98%～24.12%之间；再分别精密吸取混合均匀的汤剂40～50 mL，用pH计测定pH值，15批化湿止咳汤pH值5.30～5.91之间。

2.2 TLC法对白术、甘草的鉴别

2.2.1 白术的鉴别 取本品40 mL，用乙酸乙酯振摇淬取3次，每次25 mL，合并淬取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取白术对照药材2 g，加甲醇20 mL，加热回流1 h，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。按照“化湿止咳汤制备工艺”制备缺白术的“阴性对照溶液”，按照“供试品溶液方法”制备，即得。照《中国药典》2015年版第四部薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液、缺白术阴性溶液各10 μL、对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(2∶1)为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，晾干，置紫外灯365 nm下检视。供试品色谱中，在对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点如图A所示。

1、2和3：20200401、20200402、20200403

2.2.2 炙甘草的鉴别 取炙甘草对照药材2 g，加甲醇20 mL，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液；按照“化湿止咳汤制备工艺”制备缺炙甘草的“阴性对照溶液”，按照“供试品溶液方法”制备，照《中国药典》2015年版第四部薄层色谱法(通则0502)试验，吸取白术鉴别项下供试品10 μL、对照药材溶液及缺炙甘草阴性溶液各3 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水(15∶1:1∶2)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外灯下(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图B所示。

2.3 指标成分含量测定及指纹图谱建立

2.3.1 对照品溶液 精密称定甘草苷对照品0.0055 g，置5 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液制成每1 mL含甘草苷1.1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 精密量取样品溶液6 mL，蒸干，残渣置5 mL容量瓶中，加70%乙醇超声处理10 min，定容至5 mL，作为供试品溶液。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGⅢ(4.6 mml.D×250 mm，5 μm)流动相：1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度进行洗脱：0～10 min，10%～35%(B)；10～20 min，35%～45%(B)；20～28 min，45%～37%(B)；28～35 min，45%～37%(B)；35～40 min，37%～50%(B)流速：1.0 mL·min-1；检测波长：269 nm；柱温：25 ℃；进样量：1 μL。

2.3.4 线性关系的考察 精密量取“2.3.1”项下甘草苷对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1 mL分别置于5 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，照“2.3.3”项下色谱条件进行，测定甘草苷含量，以甘草苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=709430X-1986.4，r=0.999，表明化湿止咳汤在0.022～0.132 mg/mL内线性良好。

2.3.5 精密度试验 取同一批化湿止咳汤供试品溶液(20200401)，按“2.3.3”项下色谱条件连续进样6次，测定并计算甘草苷峰面积RSD=1.46%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取同一批供试品溶液(20200401)，按“2.3.3”项下色谱条件连续试验6次，甘草苷平均含量：0.053 mg/mL，RSD= 2.03%，表明该方法重现性良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液(20200401)，于制备后的0、4、8、10、12、24 h，按“2.3.3” 项下色谱条件进行试验，测定甘草苷峰面积，结果色谱峰RSD为1.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验 精密量取已知含量化湿止咳汤(0.045 mg/mL)9份(批号： 20200401)，分成3组，每组3 mL，以供试品溶液中甘草苷含量的80%、100%、120%为梯度，加入对照品溶液适量，照“2.3.2”项下同法制备，再按“2.3.3”项下依法测定，计算回收率。见表1。

表1 甘草苷加样回率试验结果

3 化湿止咳汤含量测定

取3批制备样品(20200401、20200402、20200403)，按照“2.3.2”项下同法制备供试品溶液，再按“2.3.3”项下依法测定甘草苷含量，结果见表2，图谱如图2a所示。

表2 三批化湿止咳汤含量测定

4 阴性溶液的制备

按照“1.3”项下制备缺甘草化湿止咳汤汤剂，再按照“2.3.2”项下同法制备及“2.3.3”项下依法测定，缺甘草苷如图2b所示，甘草苷对照品图谱如图2c所示。

a

5 指纹图谱的建立

按照“2.3.2”项下同法制备供试品，再按“2.3.3”项下色谱条件，依次进样测定化湿止咳汤剂样品溶液 (S1～S15)， 记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相识度评价系统》(2012.130723版本)，对15批次化湿止咳汤剂的实验结果进行评价。图3为化湿止咳汤生成的图谱。根据软件匹配确定21个共有峰，15批次化湿止咳汤剂生成的对照指纹图谱的相识度均大于0.91，以保留时间为指标，与对照品色谱图相比，可得出9A峰为甘草苷，如图3所示。

图3 十五批化湿止咳汤HPLC图

6 讨论

中药汤剂是最古老、最基本的剂型，受广大患者好评。但是，中药汤剂受多种因素如药材基源、产地、煎煮等影响，从而影响治疗效果的发挥[5]。因此，为了保证汤剂有效性、安全性，建立汤剂质量标准，有着重要的意义。在中药质量研究中，基准物质作为标准参照的研究在中药中较为成熟。1986年日本厚生对中药口服制剂提出了基准物质概念，要求制定标准汤剂的化学基准和生物基准，用来与汤剂相比，从而保证质量[6]。2016年8月中国国家药典委员会在《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要(征求意见稿)》中提出了标准汤剂的概念，还对标准汤剂进一步说明[7-8]。基于此，本研究对15批中药制备的化湿止咳汤进行质量研究，以出膏率、pH、含量测定为指标，还采用指纹图谱进行分析。化湿止咳汤主要由广藿香、山药、白术、法半夏、炙甘草、炒紫苏子组成，本研究利用传统煎煮法得出15批中药制备的化湿止咳汤出膏率为：15.98%～24.12%之间，平均出膏率为20.11%，15批化湿止咳汤最低出膏率与最高出膏率之间相差8.14%，对三批化湿止咳汤中甘草苷进行含量测定，结果为0.049、0.051、0.049 mg/mL，这表明出膏率、pH值、含量测定各结果之间相差不大，较为平稳，可作为化湿止咳汤的质量控制标准。

此外，还对15批化湿止咳汤进行指纹图谱分析，从图谱中可得出，共确定21个共有峰，通过与对照品比对，确定9A峰为甘草苷且重现好。因此，运用标准汤剂理念对复方制剂进行质量控制研究，不仅提高汤剂内在质量，而且对经典名方、协定处方制备提供理论支撑，也突出了中药多方位、整体控制理念，为该制剂作为医疗机构制剂的研究提供实验基础。