复方丹参片含量测定与化学模式识别研究

崔新刚 王颖莹 王新胜

1.河南省洛阳市妇幼保健院，河南 洛阳 471000；2.河南省洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471000；3.河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471000

复方丹参片系由丹参、三七、冰片组成的中药复方制剂，具有活血化瘀，理气止痛作用，为《中国药典》2015版收载的成方制剂[1]。主治气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛[2]。目前，我国已有数家药厂的复方丹参片投放市场，但临床反映不同厂家复方丹参片的疗效存在明显差异。化学成分研究显示不同厂家复方丹参片中有效成分含量差异显著[3-4]。为了评价不同厂家复方丹参片的质量差异，陈永等[5]测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，评价复方丹参片质量。马启武[6]测定复方丹参片中丹参酮IIA、丹酚酸B的含量，比较其质量差异。现有报道中提到的评价方法常以其中一味药评价其质量，通常为方中的君药或臣药，不能全面反映其质量差异。本研究参考《中国药典》2015年版中对复方丹参片的检测方法，在《中国药典》检测方法的基础上对检测条件进行了优化，将丹参酮IIA、丹酚酸B及三七总皂苷含量作为质量评价指标。为了更好的综合比较、评价不同厂家复方丹参片的质量，本研究以复方丹参片中丹参酮IIA、丹酚酸B、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1及人参皂苷Re为指标，进行聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，旨在为其质量控制提供依据和参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪，包括G1315B型二极管阵列检测器、自动进样器(美国安捷伦科技有限公司)；KQ-100ES超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；赛多利斯BSA8201电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；易普易达Smart-S2型超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司)。

1.2 药品与试剂 丹参酮ⅡA对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110766-201816)；丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111562-201702)；人参皂苷Rg1对照品(中国食品药品检定研究院，批号：l10703-201728)；人参皂苷Rb1对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110704-201722)；三七皂苷R1对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110745-201614)；人参皂苷Re对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110754-201823)。样品分别购于不同厂家共10批次，每个厂家购买2个批次，分别为北京A公司(批号：20190933；20190331，编号S1-2)、广州的B公司(批号：L18A011；L18A017，编号S3-4)、云南的C公司(批号：201811；201910，编号S5-6)、湖北的D公司(批号：20190910；20190814，编号S7-8)、上海的E公司(批号：201906107；201811027，编号S9-10)。甲醇、乙腈为色谱纯(天津天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Sysmetry C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：甲醇-水(73：27)；进样量：10 μL；检测波长：270 nm。

2.1.2 对照品制备 精密称取丹参IIA对照品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含对照品40 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.1.3 供试品制备 取本品10片，糖衣片需先除去糖衣，精密称定，研细粉，取约1 g细粉，置于具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量。将所制得供试品溶液进行超声处理(功率250W，频率33kHz)15 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色瓶中，即得供试品溶液。

2.1.4 方法学考察[2]

2.1.4.1 重复性试验 取复方丹参片(批号：20190933、L18A011、201811、20190910、2019061 07，即S1、S3、S5、S7、S9)按供试品溶液的制备方法分别平行制备6份供试品溶液，按2.1.1色谱条件检测丹参酮IIA的平均含量，结果见表1，表明本方法重复性良好，精密度较高。

2.1.4.2 稳定性试验 取复方丹参片(批号：20190933、L18A011、201811、20190910、201906107)供试品溶液，按本试验色谱条件分别于0、2、4、6、8 h进行检测，计算丹参酮IIA峰面积RSD，结果见表1，表明本方法稳定性良好。

2.1.4.3 加样回收率试验 取已知含量复方丹参片样品(批号：20190933、L18A011、201811、20190910、201906107)，分别加入一定量的对照品溶液后，测定含量，计算回收率，结果见表1，回收率良好。

2.1.5 样品测定 按2.1.3制备样品溶液，精密吸取样品溶液和对照品溶液各10 μL，按2.1.1色谱条件，分别测定10个样品中的丹参酮IIA，以外标法计算含量。色谱图见图1，测定结果见表1。

图1 对照品(A)和样品(B)色谱图

2.2 丹酚酸B的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Sysmetry C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈-甲醇-甲酸-水(10∶30∶1∶59)；进样量：10 μL；检测波长：286 nm。

2.2.2 对照品制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，置于棕色量瓶中，加水制成每1 mL含对照品60 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.3 供试品制备 取本品10片，糖衣片需先除去糖衣，精密称定，研细粉，取0.15 g细粉，置于50 mL棕色量瓶中，加水适量，将所制得供试品溶液进行超声处理(功率300W，频率50kHz)30 min，放冷，加水至刻度，摇匀，离心机离心，取上清液，即得供试品溶液。

2.2.4 方法学考察 按照2.1.4方法，结果见表1，表明本方法重复性良好，精密度较高，稳定性良好，回收率良好。

2.2.5 样品测定 按2.1.4样品测定方法。色谱图见图2，测定结果见表1。

表1 方法学考察结果

图2 对照品(A)和样品(B)色谱图

2.3 三七总皂苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Sysmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按规定条件进行梯度洗脱，详见表2；进样量：10 μL；检测波长：203 nm。

表2 不同厂家指标成分含量测定结果(mg/片)

表2 三七总皂苷流动相条件

2.3.2 对照品制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、三七皂苷R1对照品及人参皂苷Re对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1各0.2 mg，三七皂苷R1及人参皂苷Re各0.05 mg的混合溶液，即得对照品溶液。

2.3.3 供试品制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细粉，取约1 g，精密称定，精密加入70%甲醇50 mL，称定重量，将所制得供试品溶液进行超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。。

2.3.4 方法学考察 按照2.1.4.方法，结果见表1，表明本方法重复性良好，精密度较高，稳定性良好，回收率良好。

2.3.5 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定。色谱图见图3，测定结果见表1。

图3 对照品(A)和样品(B)色谱图

2.4 主成分分析 以10批复方丹参片中的指标成分含量测定结果为变量，运用SPSS Statistics 18.0软进行主成分分析，计算成分特征值、贡献率及累计贡献率，前2个主成分累计贡献率为96.692%，可以反映复方丹参片质量，结果见表3。将10批复方丹参片中指标成分含量结果导入SIMCA-P 14.5软件，得分矩阵图见图4。S1～2为一类，S3～6为一类，S7～10为一类。

2.5 聚类分析 以复方丹参片的指标成分含量结果为变量，运用SPSS Statistics 18.0统计软件，采用组间连接法，以欧式平方距离为度量标准进行系统聚类分析，结果见图5。由图可知在组间距为25时，10批样品分为3类，S1～2为一类，S3～6为一类，S7～10为一类，该结果与主成分分析结果一致。

2.6 正交偏最小二乘判别分析 以含量测定结果为变量，导入SIMCA-P1 14.5软件，进行正交偏最小二乘判别分析，模型参数为R2X为1，R2Y为0.892，Q2为0.312，说明矩阵良好，得分矩阵图见图6。分类结果与主成分分析、聚类分析结果一致。以VIP值大于1位标准，筛选得到指标成分三七皂苷R1、丹酚酸B和人参皂苷Re为复方丹参片的差异组分，见表3。

表3 主成分特征值和贡献率

表4 复方丹参片中指标成分的VIP值

图6 复方丹参片正交偏最小二乘判别分析得分图

3 讨论

复方丹参片为我国的现代中药复方制剂，是常用临床药。表1可知，不同厂家生产的复方丹参片都符合《中国药典》2015版标准，每片含丹参酮ⅡA不得少于0.20 mg，丹酚酸B不得少于5.0 mg，人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1、三七皂苷R1及人参皂苷Re的总量不得少于6.0 mg。但主成分分析和聚类分析结果表明，不同厂家生产的复方丹参片间存在一定的差异，正交偏最小二乘判别分析结果表明三七皂苷R1、丹酚酸B和人参皂苷Re是控制复方丹参片的关键成分。

基于主成分分析和聚类分析结果，同一厂家不同批次的样品聚为一类，说明同一厂家化学组分差异较小，质量较稳定。由图4～5可知，不同厂家如两个厂家编号S3～4与S5～6，厂家S7～8与厂家S9～10复方丹参片聚为一类，结果表明这些生产厂家可能在原料来源和生产工艺具有类似之处。本研究获得的结果为复方丹参片的质量控制提供依据。