泛素/26S蛋白酶体途径调节作物种子大小的研究进展

崔超, 赵阿慧, 李芳, 高翔,2*, 邢玲玲,董剑,2, 赵万春,2, 杨明明,2*

(1.西北农林科技大学农学院, 陕西 杨凌 712100; 2.陕西省小麦新品种培育工程研究中心, 陕西 杨凌 712100; 3.博爱县农业农村局, 河南 焦作 454450)

高产是作物育种永恒不变的目标。对于禾谷类作物，种子大小和构型是影响产量的重要因素[1]。种子大小是由多基因控制的数量性状，受多种途径的调控，包括泛素/26S蛋白酶体系统(ubiquitin/26S proteasome system，UPS)、G蛋白信号、丝裂原活化蛋白激酶信号、植物激素感知和体内平衡以及转录调节因子等[1-2]。野生植物为了繁衍后代，大多都维持着小种子的特性。但是，水稻、小麦、玉米等以收获种子为目标的粮食作物，在不断的人为选择和驯化过程中，籽粒逐渐变大。随着人口不断增长，研究作物种子大小及其调控机理对人类粮食安全至关重要。

成熟完整的种子由胚、胚乳和种皮组成[1-2]。植物双受精过程中，一个精细胞与卵细胞结合形成受精卵，发育成二倍体的胚；另一个精细胞与中央细胞结合，发育成三倍体的胚乳；珠被发育成种皮。胚、胚乳和种皮的协调生长决定着种子的大小[1]。小麦、玉米、水稻等禾本科植物种子的种皮与果皮紧密连接在一起，难以区分，因此，果皮与种皮的空腔大小共同决定了种子的大小。果皮由子房壁发育而来，种皮由珠被发育而来，通常子房壁和珠被均由母体遗传物质控制。因此，种子大小由母体的遗传物质与合子的遗传物质共同决定[1-2]。另外，小麦、水稻等植物包裹种子的颖壳也由母体遗传物质控制[1]，由此表明，母体遗传物质在种子大小的调控中发挥重要作用。

泛素/26S蛋白酶体系统普遍存在于真核生物蛋白质翻译后的修饰过程中，据报道，拟南芥中约6%的基因组参与其中[3-6]。该系统由泛素、泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和去泛素化酶组成[3-5]。其中，泛素连接酶在该系统中起特异识别作用，通过在目标蛋白上连接不同数量的泛素进行泛素化修饰来介导目标蛋白的降解和改变蛋白活性等，对植物非生物胁迫响应、信号传递、种子大小、开花时间、育性等方面起着重要作用[3-5]。

1 泛素/26S蛋白酶体系统组成

1.1 泛素

泛素(ubiqutin，Ub)于1975年首次被纯化，是一种高度保守的低分子量蛋白质，广泛存在于真核细胞中，由76个氨基酸组成，分子量约为8.5 kD[4-5]，可共价连接到目标蛋白，导致目标蛋白以依赖ATP和Mg2+的方式降解[5]。泛素的稳态受去泛素化酶的严格调控[5]。拟南芥(Arabidopsisthaliana)中有14个泛素编码基因，可分为三种类型：多聚泛素基因、类泛素基因和泛素延伸基因。其中，多聚泛素基因和类泛素基因由228 bp的单泛素串联重复组成[4]。在单个泛素分子中包括7个赖氨酸残基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、Lys63)组成的ε-氨基或泛素N端氨基，它们可与下一个泛素的C端羧酸相连形成聚合泛素链，不同部位的连接参与不同的调控[4]。目标蛋白可以在一个或多个位点连接一个泛素分子(单泛素化)，也可以在一个或多个位点连接泛素链(多泛素化)[5]。

1.2 泛素激活酶

泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1s)大小为110～125 kD[6]，可以将失活的泛素活化。不同生物中泛素激活酶的编码基因数量不同，在酵母中含有1个[4]，拟南芥和烟草(Nicotianatabacum)中存在2个[4-5]，小麦(Triticumaestivum)中发现3个[5]，而大豆(Glycinemax)中报道了4个[4,6]。E1s含有四个不同的结构域：两个ThiF同源基序组成的腺苷酸化结构域、两个半结构域(first catalytic cysteine half-domain，FCCH；second catalytic cysteine half-domain，SCCH)组成的催化半胱氨酸结构域、四螺旋束结构域(four-helix bundle，4HB)和C末端泛素折叠结构域(ubiquitin-fold domain，UFD)[4,6]。E1s的C末端泛素折叠结构域可特异性识别同源泛素结合酶[6]。

1.3 泛素结合酶

泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2s)中有一个保守的半胱氨酸残基作为活性位点与泛素分子(Ub)形成硫酯键，泛素活化酶E1将泛素转移到E2的半胱氨酸活性位点上，形成Ub-E2复合体。E2s的半胱氨酸(Cys)残基位于高度保守的泛素结合结构域(ubiquitin-conjugating，UBC)[4,6]。在拟南芥中有8种UBC蛋白缺乏硫酯形成所需的活性位点Cys残基[6]。起初，E2s被认为是起辅助作用的“泛素载体”，而最近研究表明，E2s可以控制泛素链从起始到延伸的转换，并控制形成泛素链的拓扑结构，从而决定被修饰目标蛋白的使命[6]，例如：修复DNA、调控植物生长发育、响应胁迫等[4]。

1.4 泛素连接酶

泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzymes，E3s)在蛋白质的泛素化过程中起特异性识别目标蛋白的关键性作用。拟南芥中约5%的基因组与泛素连接酶有关[4]，大豆中有1 356个基因与E3s相关[6]。根据结构域可以将E3s分为四大类：HECT(homologous to the E6-AP carboxy terminus)结构域家族、RING(really interesting new gene)结构域家族、U-box结构域家族和CRLs(cullin-RING ubiquitin ligases)结构域家族[3-6]。其中，HECT型、RING型和U-box型为单亚基E3s，而CRLs型为多亚基E3s[3-6]。

1.4.1HECT型E3s HECT型E3s的C端为α/β结构[4]，其保守结构域HECT约由350个氨基酸组成[3-4,6]，具催化作用，其催化活性位点为Cys820，介导Ub从E2到目标蛋白的直接转移[4-5]。HECT的典型结构为E6-AP[4]。拟南芥中有7种HECT蛋白，分别为UPL1～UPL7[5]。

1.4.2RING型E3s RING型E3s的结构域约由40～60个氨基酸组成，富含Cys[3,5]，协调两个锌原子[5]。拟南芥中有超过470种蛋白质包含RING结构域[5]。研究证明，RING型E3s在植物不同发育过程中均有重要作用，包括种子萌发、生长、根发育、光信号转导、配子形成、器官大小和对非生物胁迫的响应等[3-5]。RING型E3s数量众多，在拟南芥中有469个基因编码RING型E3s，大豆中有760个[6]。目前RING型E3泛素连接酶的研究已逐渐成为热点[3-6]。拟南芥中已鉴定出7种类型的RING结构域，包括两种典型的RING类型(RING-HC和RING-H2)和五种修饰的RING结构域类型(RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T和RING-G24-27)[7]。与HECT型E3s相反，RING结构域主要通过8个氨基酸与Zn2+的螯合形成共价键来间接转移泛素[3]。除此之外，RING型E3s也参与多亚基E3s的形成[4]。

1.4.3U-box型E3s U-box结构域由约70个氨基酸组成，缺乏经典的锌螯合Cys和组氨酸(His)残基[3]，主要通过盐桥、离子螯合以及氢键从E2s转移泛素至目标蛋白，进行泛素化修饰[4]。植物中有较多的U-box型E3s[3]。其中，拟南芥检测到64个成员，水稻中有77个成员[3]，大豆中有124个成员[6]，这类蛋白可能参与植物自交不亲和、种子萌发、花期、叶绿体发育和非生物胁迫响应等[5]。

1.4.4CRLs型E3s CRLs型E3s是多亚基E3s，由cullin骨架蛋白、E2结合蛋白RBX1 (RING box 1)和结合cullin的底物识别亚基构成[3]。CRLs型E3s又可分为四个亚家族：SCF(SKP1-Cullin1-F-box)、BTB(Bric-a-brac-Tram track-Broad)、DDB(DNA Damage-Binding domain-containing)和APC(anaphase-pro-moting complex)[4-5]。其中，SCF亚型E3s由SKP1(sphase kinase-associated protein 1)、CUL1(cullin 1)、RBX1(RING-box 1)和FBX(F-box)蛋白组成，FBX蛋白决定底物特异性[5]。拟南芥中有超过700个基因参与CRLs型E3s，部分基因参与植物激素信号通路、植物发育和各种非生物胁迫响应[5]等。拟南芥中已鉴定的5种经典cullin蛋白(CUL1、CUL2、CUL3a、CUL3b和CUL4)均属于E3s复合物的组分[3]。

1.5 26S蛋白酶体

26S蛋白酶体在真核细胞中负责蛋白质的降解，以消耗ATP的形式特异性将靶蛋白降解成由7～9个氨基酸残基组成的多肽。结构上由19S调节亚基和20S核心亚基组成[5,8]。其中，19S调节亚基能够识别带有泛素链标记的蛋白质底物并将其去折叠，然后将去折叠后的蛋白质底物运送至20S核心亚基中进行降解[8]。26S蛋白酶体参与了植物的绝大多数生命活动[8]。它能将含有泛素链(≥4个泛素分子)的目标蛋白降解为较小的肽段，而释放的泛素分子则被回收[5]；对于单泛素化蛋白质无法进行降解，但单个泛素分子通过与泛素受体蛋白结合会影响其他修饰蛋白的功能或活性，进而调控植物的生长发育[5]。

1.6 去泛素化酶

去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)具有从线性串联重复序列中产生游离泛素的功能，还能够通过水解泛素分子之间的异肽键来修剪泛素链，以及从蛋白质中去除共价结合的泛素。DUBs是一个大的蛋白质家族，根据其特有的催化结构域可分为五类：泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP/UBP)、泛素碳末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢肿瘤结构域蛋白酶(ovarian tumor domain protease，OTU)、Machado-Jo-seph疾病蛋白结构域蛋白酶(machado-jo-seph disease protein domain protease，MJD)和JAMM基序蛋白酶(jab1/mpn/mov34 protease，JAMM)[9]。

2 泛素介导的26S蛋白酶体降解途径

UPS系统由Ub、E1s、E2s、E3s、DUBs、26S蛋白酶体组成[3-5](图1)。首先，细胞质与细胞核中的E1s在ATP参与下将失活的Ub激活；Ub的C末端和E1s的Cys残基之间以硫酯键结合(E1-Ub)。然后，硫酯连接的泛素(E1-Ub)被转移到E2s的Cys残基活性位点上，再经过硫酯键进行结合，形成E2-Ub。此时E3s与目标蛋白和E2-Ub形成复合物，直接或间接介导活化的Ub转移到目标蛋白上，使Ub分子C端的甘氨酸(Gly)残基与目标蛋白的赖氨酸(Lys)残基之间形成异肽键[5]。Cys残基是整个E3s具有活性的关键残基。此外，包括半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸在内的残基也可以被泛素修饰[5]。直接转移的E3s为HECT型E3s，可将Ub转移至E3s，形成E3-Ub，E3-Ub中E3与目标蛋白结合后进行旋转，使得Ub与目标蛋白进行结合；间接转移的E3s有RING型、U-box型和Cullin-based型，E2-Ub直接与目标蛋白结合，E3发挥桥梁作用。最后，含有多聚泛素链(≥4个泛素分子)修饰的目标蛋白被26S蛋白酶体降解，释放Ub[3-6]。

3 泛素/26S蛋白酶体系统调节器官和种子大小

3.1 泛素受体类基因

拟南芥AtDA1是一个泛素受体类基因，其编码蛋白包含两个泛素相互作用的基序(ubiquitin iteraction motifs, UIM)结构域、一个LIM结构域和一个C末端肽酶结构域[10-11]。AtDA1对于种子大小具有重要作用[10,12-19]。它通过限制母体珠被中的细胞增殖来控制种子大小[10-11,14]。该基因第358位点的碱基由G突变为A(AtDA1R358K)后，导致原本的精氨酸变异为赖氨酸，使得突变体种子和器官的大小增加[10]。DAR1和DAR2(DA1的两个同源基因)也具有调控种子大小的作用。

甘蓝型油菜BnDA1基因发生突变后，突变体Bnda1的种子产量和生物量得到提高。过表达AtDA1R358K增加了转基因油菜的千粒重和器官大小，提高了单株产量。由此可见，BnDA1和AtDA1在调控种子和器官大小方面具有相似的功能[12]。

玉米ZmDA1或ZmDAR1发生突变后，突变体Zmda1和Zmdar1穗长增加，导致行粒数增加。且突变体比野生型具有更加发达的基生胚乳转移细胞层(basal endosperm transfer cell layer，BETL)，增强了淀粉合成酶基因的表达，改善了糖向库器官的输入以及玉米籽粒中淀粉的合成。ZmDAR1主要在玉米胚乳发育中起作用，ZmDA1在胚发育中起重要作用，糖与淀粉含量的增加使胚乳或胚增加，导致籽粒重量增加。这与AtDA1/AtDAR1调控种子大小存在一定差异，可能是由于两个物种调控途径中降解的底物不同，ZmSWEET4c可能是ZmDA1的潜在底物[13]。

普通小麦TaDA1基因通过限制母体果皮细胞的增殖来负调控小麦籽粒大小。TaDA1-A与TaGW2-B对粒重具有加性效应，同时下调TaDA1和TaGW2的表达使小麦的籽粒大小与重量增加。TaDA1位于小麦2A、2B和2D染色体，TaDA1-B和TaDA1-D主要在营养器官(如叶和根)中表达，而TaDA1-A主要在生殖器官(如幼穗)中表达，可能在籽粒重量和大小方面起重要作用[14]。DA1基因第358位点发生突变会抑制DA1和DAR1蛋白的活性，使得拟南芥、油菜和玉米的种子大小增加[10,12-13]。但是，这种突变至今还没有在自然变异中被发现。Liu等[14]研究表明，启动子区域的变异会改变TaDA1-A三种单倍型的表达水平。

水稻中鉴定出4个同源基因OsDA1、OsDAR2、OsDAR3和OsDAR4[15,18]。这些同源基因可能作为转录因子来正向调控水稻的粒宽和粒长，从而增加千粒重和单株产量[15,18]。李爱芹等[17]研究表明，OsDA1基因的启动子区存在多个不同激素和逆境信号响应的顺式作用元件，但这些元件的类型与拟南芥DA1基因的顺式作用元件有所不同，OsDA1与AtDA1可能在表达调控上存在差异[15,17-18]；OsDA1基因不仅能够调控种子等器官的大小和发育[17]，还可能与激素信号转导和逆境响应有关[16-17]。郝健均[19]指出，OsDA1R310K的过量表达使转基因植株的器官(营养器官和生殖器官)和种子增大。

对栽培大豆(Glycinemax,G.ma)和野生大豆(Glycinesoja,G.so)的DA1基因在序列和表达水平进行比较，GsoDA1基因在根、茎和叶中的表达水平高于生殖器官和发育中的果实，该基因的过表达影响了转基因拟南芥种子的萌发和对盐胁迫的敏感性，但对种子大小无显著影响[16]，这与拟南芥[10]、甘蓝型油菜[12]、玉米[13]和普通小麦[14]中的研究结果不一致。由此可见，DA1基因在植物中可能具有多种功能，同源基因间的保守性及其功能受亲缘关系远近的影响[19]。

3.2 泛素连接酶类基因

3.2.1GW2基因OsGW2是水稻中发现控制粒宽和粒重的RING型E3类主效基因，在不同组织中均有表达。OsGW2基因的功能是通过泛素介导的蛋白质水解调控细胞分裂，改变小穗颖壳中的细胞数量。该基因第4个外显子发生1 bp的缺失突变，形成终止密码子，使该基因提前终止(在第310个氨基酸处被截断)，导致粒宽、粒重和籽粒灌浆速率增加[7]。OsGW2与几丁质酶14和磷酸甘油酸激酶相互作用，但不会使这些蛋白质泛素化，而是通过调节参与碳水化合物代谢的蛋白质活性或稳定性以及种子发育过程中二硫键的形成来控制糊粉层的发育，直接调控种子大小[20]。OsGW2与膨胀素(一种促进细胞生长的细胞壁松弛蛋白)共定位于细胞核， OsGW2通过其E3活性促进膨胀素降解而负调控种子大小[21]。在日本品种(Koshihikari)中发现一个突变体KEMS39，其籽粒大小和产量显著增加，并且节间较厚，耐贮藏性和抗倒伏能力提高，研究表明，该突变体的OsGW2基因第6个内含子的3′剪接位点发生突变，导致mRNA中存在67 bp的缺失[22]。

玉米中发现了OsGW2的两个同源基因：ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5。ZmGW2-CHR4启动子区发现了一个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，该多态性与籽粒宽度和百粒重显著相关，ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5其他区域的SNPs(插入/缺失多态性)也发现与产量性状(籽粒长度、籽粒厚度、籽粒宽度和百粒重)显著相关[23]。ZmGW2可以被高盐(NaCl)和脱落酸(abscisic acid，ABA)诱导[24-25]，具有抗旱和抗冷害的能力，将过表达ZmGW2载体和AtGW2RNA干扰(RNA interference，RNAi)载体转入拟南芥发现，AtGW2RNA干扰植株后代的籽粒比过表达ZmGW2转基因后代的更大，千粒重更高，表明ZmGW2具有负调控种子大小及粒重的作用[24-25]；非生物胁迫处理后，ZmGW2转基因植株长势均优于野生型，表明其在逆境胁迫响应中也发挥作用[24]。

大豆GmGW2全长8 467 bp，包含8个外显子和7个内含子，编码431个氨基酸，不含跨膜结构域及信号肽，编码具有Zinc finger和RING-type结构域(第50～100个氨基酸)的不稳定亲水蛋白[26-27]。

小麦TaGW2-6A的启动子区存在2个SNPs：Hap-6A-A(-593A和-739G)和Hap-6A-G(-593G和-769A)。TaGW2表达水平与粒宽呈负相关，而Hap-6A-A的作用类似于水稻中功能缺失突变，导致粒宽和粒重增加[28-30]。Bednarek等[31]通过RNAi和基因敲除表明，TaGW2可能通过控制胚乳细胞数量正向调控小麦籽粒大小。因此，小麦和水稻中GW2基因似乎具有相反的功能[31]。Yang等[32]在兰考大粒品种TaGW2-6A基因的第8个外显子中发现了一个T碱基插入形成的终止密码子，该单倍型在杂交分离群体中可以稳定遗传，该突变可以显著提高小麦的粒宽和粒重[32]。进一步研究发现，通过调控细胞分裂素、赤霉素、淀粉合成来提高籽粒大小[33-36]。Jaiswal等[37]在印度小麦TaGW2-6A基因的启动子序列中鉴定出4个与千粒重显著相关的SNPs(G/A或A/G突变)[37]。Simmonds等[38]在四倍体Kronos EMS TILLING群体TaGW2-A1基因第5个外显子的剪接受体位点发现了一个从G到A的颠换，将突变等位基因Tagw2-A1回交到四倍体小麦Kronos和六倍体小麦Paragon中,能显著增加四倍体和六倍体小麦的千粒重、粒宽和粒长，并发现在开花前5 d心皮长度与宽度显著增加，推测TaGW2-A1在开花前作用于母体组织以限制种子大小[38]。利用CRISPR/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)敲除TaGW23个同源基因(TaGW2-A1、TaGW2-B1和TaGW2-D1)中的1个、2个或3个发现，敲除TaGW2-B1的突变体比敲除TaGW2-A1、TaGW2-D1具有更高的粒宽、粒长和粒重，且双突变体的千粒重显著大于单突变体[39-40]；进一步研究表明，TaGW2通过调节籽粒外层果皮中的细胞数量和长度来负调控小麦籽粒大小[39]。Qin等[41]研究表明，六倍体小麦中TaGW2-6B对千粒重的影响大于TaGW2-6A，且两个基因间具有加性效应。Zhai等[42]在高千粒重亲本中发现TaGW2-A1基因的5’侧翼区缺失了114个碱基，导致TaGW2-A1启动子的活性和表达量降低，对小麦千粒重和粒宽起负调控作用。

大麦中HvYrg1和HvYrg2是水稻GW2的同源基因，该基因的表达量下调导致千粒重增加，种子变大，且营养器官也发生较大变化[43]。

3.2.2EOD1/BIGBROTHER基因 拟南芥中EOD1(enhancer of DA1,EOD1)突变增强了da1-1突变体种子和器官的大小[10,44]。EOD1基因被定位于BIGBROTHER(BB)位点，编码一种泛素连接酶，该蛋白含有一个RING型结构域，在拟南芥活跃组织(茎、花、根的分生组织和幼嫩器官)和维管束系统中表达，通过E3活性降解目标蛋白来调控器官的发育，对器官形态起负调控作用[45-46]。EOD1/BB的E3活性和泛素受体活性与DA1的潜在偶联单泛素化活性密切相关，由此表明，泛素细胞信号机制直接参与植物器官大小的调控[10]。在营养器官中，BB基因的表达水平与有丝分裂活动密切相关；在有丝分裂活动旺盛的器官中表达量较高，且表达量随着细胞有丝分裂活动的减少而降低[45]。通过对P271(大籽粒)和中国春(小籽粒)小麦发育初期的籽粒进行转录组和蛋白质组数据的关联分析发现一个新型BB基因Tares_1AL_B4BCDBC4A，该基因在籽粒发育初期表达量显著增加，并且在籽粒发育过程中均维持较高水平；其氨基酸序列在487～533位置上含有一个典型的Zinc finger RING-type结构。将该基因转入科农199，转基因株系的籽粒显著变小。除此之外，还发现细胞色素酶基因TaCYP78A5在中国春及P271中的表达量存在极显著差异，推测该基因可能与BB基因相互作用参与籽粒大小的调控[47-49]。

3.2.3DA2基因 拟南芥DA2基因的编码蛋白(DA2)具有E3活性，含有一个RING型结构域，在根、茎、叶和花中均有表达，通过影响种子中母体珠被细胞的增殖来调控种子大小。da2-1突变体的种子显著大于野生型，而DA2的过表达使转基因植株的种子减小[44]。DA2的RING域与水稻GW2的环域(C5HC2)高度相似，但DA2 RING域中保守的His残基被Asn残基(Asn-91)取代。研究表明，DA2与DA1间存在协同互作[50]，而DA2和BB相互独立[44]。

3.2.4SDIR1基因SDIR1基因编码具有RING结构域的E3 SDIR1(salt-and drought induced really interesting new gene finger 1)，在植物信号调节通路中发挥重要作用。小麦TaSDIR1-4D共检测到2个SNP，一个位于编码区上游序列-583 bp处(T/C)，另一个位于编码区第4外显子上(G/A)，使精氨酸(Arg)变为组氨酸(His)，两种单倍型的千粒重和穗长存在显著差异[51]。

SDIR1的N端含有两个跨膜结构域，C端含有一个C3H2C3环型结构域，在植物中通过泛素化途径对盐和干旱胁迫下ABA介导的抗逆反应起关键作用[52]。小麦TaSDIR1-4A与千粒重显著相关，基因表达分析表明TaSDIR1-4A在旗叶中表达量最高；该基因启动子区存在两个核苷酸变异位点，产生两种单倍型Hap-4A-1和Hap-4A-2，Hap-4A-1的表达量显著高于Hap-4A-2，而Hap-4A-2的千粒重显著高于Hap-4A-1，这种差异可能是由于在Hap-4A-2中TaERF3(乙烯反应因子)对TaSDIR1-4A的转录阻遏作用，因此，TaSDIR1-4A对籽粒大小起负调控作用[52]。正常条件下TaSDIR1-4A的低水平表达可能有助于提高小麦产量；而在非生物胁迫条件下，TaSDIR1-4A的上调可能有助于胁迫响应，但可能会降低产量。这表明TaSDIR1-4A是复杂网络的中央控制单元，在不断变化的环境条件下平衡响应[52]。

3.2.5PUB1基因 U-box型E3s基因在逆境胁迫和激素应答等方面起重要作用[5]。大豆GmPUB1基因编码439个氨基酸，分子质量为48.63 kD，GmPUB1蛋白具有U-box结构域，在细胞核和细胞质内均有分布。过表达GmPUB1的转基因拟南芥千粒重显著提高[53]。

3.2.6后期促进复合物 后期促进复合物(anaphase-promoting complex，APC)是一种多亚基E3，通过泛素化细胞周期蛋白来调控有丝分裂进程。SAMBA是APC的负调控因子，通过影响细胞增殖来调控种子和器官的发育[54]。samba突变体表现出较大的种子和器官，研究显示，其细胞周期蛋白A2;3含量增加，由此表明SAMBA通过调节A型细胞周期蛋白的稳定性来调控种子大小；并且samba与da1-1、eod1-2对种子和器官大小起协同作用，SAMBA可能与DA1和BB在同一途径中对种子大小起调控作用[54]。

3.3 去泛素化酶基因调节种子大小

3.3.1SOD2/UBP15基因 拟南芥中泛素特异性蛋白酶15(ubiquitin-specific protease 15, UBP15)是一种去泛素化酶，由DA1的抑制因子2基因(suppressor 2 ofDA1,SOD2)编码，它通过促进胚珠、珠被和发育中种子细胞增殖，在母系中正向调节种子大小[50]。sod2/ubp15突变体形成小种子，而SOD2/UBP15过表达使转基因植株种子变大。DA1与UBP15物理结合并调节UBP15的稳定性。UBP15的C末端区域是与DA1相互作用的必要元件[50]。UBP15可以被多重单泛素化的DA1切割，失去功能导致种子变小[11]。

水稻中OsUBP15与拟南芥AtUBP15同源，由LG1编码，具有去泛素化酶活性。OsUBP15的功能缺失或下调导致籽粒变小，相较于野生型OsUBP15，突变体Osubp15增强了蛋白的稳定性，且OsUBP15与OsDA1存在直接作用[55]。遗传分析表明，OsUBP15和OsGW2在调节籽粒宽度和大小方面可能存在互作，OsUBP15通过影响小穗颖壳内的细胞增殖正向调控粒宽和籽粒大小[55]。

3.3.2UBP12和UBP13基因 UBP12和UBP13在DA1、DAR1和DAR2的上游起作用，可以从这些蛋白质中去除泛素以影响它们的蛋白酶活性，使它们处于非活性状态，从而对植物的生长和发育起微调作用[56]。

3.3.3OTU1和OTUB1基因 组蛋白2(H2A和H2B)的单泛素化与植物生命活动密切相关。如H2B单泛素化会影响植物的生长、种子休眠、根和叶生长、昼夜节律钟、开花时间和光形态发生等，H2B单泛素化反过来影响组蛋白3(H3)和4(H4)的甲基化和乙酰化状态，最终导致相应基因的转录抑制或激活[57]。拟南芥中OTU1(otubain样半胱氨酸蛋白酶)为组蛋白去泛素化酶，是一种影响种子和叶片大小的核质蛋白，在幼嫩组织中表达量较高。OTU1负调控DA1和DA2的表达，其功能缺失导致靶基因转录激活；OTU1功能缺失对BB表达无显著影响，由此表明，两种泛素介导的通路可能由不同的染色质修饰因子转录调控[57]。

WTG1(wide and thick grain 1)编码一种与人OTUB1同源的去泛素化酶，属于卵巢肿瘤域蛋白酶(OTU)家族[58]。WTG1/OsOTUB1的过表达导致籽粒细长，且籽粒数量减少，wtg1-1突变体表现为宽、粗、短粒，粒重增加，穗粒数也显著增加；WTG1/OsOTUB1主要通过影响小穗颖壳中细胞膨胀来调控种子的大小和形状，还通过促进水稻OsSPL14(squamosa promoter binding protein-like 14)、IPA1(ideal plant architecture 1)、WFP(wealthy farmer’s panicle)的降解来调节株型[59]。WTG1/OsOTUB1限制OsSPL14 K63连接的泛素化，而促进K48连接的泛素化以调节其稳定性，也可能以下游细胞扩增调节剂为目标来调控种子大小[2]。

3.4 UPS对种子大小的调控网络

在拟南芥中，组蛋白去泛素化酶OTU1负调控DA1和DA2的表达，其功能缺失导致靶基因转录激活[57](图2)。转录激活后，DA2和BB都能在多个位点单泛素化DA1，从而激活DA1的肽酶活性。活性DA1肽酶可以裂解多种生长调节剂来调控种子和器官的生长，如PUB15[11]。PUB15通过调节珠被中细胞增殖来促进种子生长[50]。激活的DA1还可以反向调控裂解或破坏BB和DA2的稳定性[11]。

图2 泛素/26S蛋白酶体系统控制种子大小Fig.2 Ubiquitin/26S proteasome system controls seed size

小麦TaGW2-6A突变通过UPS阻止目标底物的降解，并调控CK和淀粉相关基因的表达，从而间接影响籽粒的灌浆速率、淀粉积累速率和胚乳细胞大小，最终影响籽粒大小和粒重[35]。

4 展望

种子大小是影响幼苗活力和早期生长的关键性状，也是决定作物产量的关键因素，而产量是关系粮食安全的重要问题[43]。种子大小是数量性状，因此具有复杂的调控机制。对种子大小调控机制的解析任重而道远。尽管已经报道了多个基因、多条途径，但大多仅限于基因功能的验证，其上下游的互作基因及蛋白仍然有待挖掘。

蛋白质翻译后修饰是一种重要的调控机制，通过在蛋白质氨基酸侧链上共价结合一些小分子化学基团来调节蛋白质的结构、活性、定位和蛋白质间的互作，从而决定蛋白质的生物学功能[60]。泛素/26S蛋白酶体系统是蛋白质泛素化的重要途径，作为一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，在作物生长发育的各个阶段发挥着重要作用。目前，编码该系统的目标基因被广泛研究，但多数集中于E3s，因为E3s在该系统中能够特异性的识别目标蛋白。泛素/26S蛋白酶体系统被鉴定为模式植物调控种子大小的保守途径[1]。DA1是该调控途径的核心成分，其作用与DAR1部分重叠[10-11]。在拟南芥、甘蓝型油菜、玉米和小麦等作物中都对DA1的功能进行了验证[11-14]。该基因在不同物种间具有相似的作用，意味着种子大小的调控机制具有一定的保守性。如水稻OsGW2的同源基因在小麦、拟南芥和玉米中被证明也具有调控籽粒大小的功能[23-25,28-40]。除已报道的基因外，仍有大量未知的E3s，其调控网络及作用机理有待进一步深入研究。因此，未来对泛素/26S蛋白酶体系统的研究仍然是一个重要的研究方向。现代分子生物学特别是基因组学和生物信息学的迅猛发展将继续推动这一进程。