Toll样受体-4、9基因多态性与胃癌发病风险的相关性研究*

周 琳，张青松，朱燕忠，赵吉光，顾园园△

1.前海人寿广州总医院检验科，广东广州 511330；2.江苏省太湖康复医院检验科，江苏无锡 214086； 安徽宣城市中心医院：3.检验科；4.肿瘤科，安徽宣城 242000

胃癌是我国发病率及病死率较高的恶性肿瘤之一。目前研究普遍认为环境因素与遗传因素交互作用导致疾病的进展并最终导致胃癌的发生，其中环境因素如饮食结构与习惯、吸烟、饮酒等被认为是胃癌的诱发因素，病原菌感染如幽门螺杆菌(Hp)、EB病毒感染是胃癌的致病因素[1]。这些易感因素的探明为胃癌的预警及重点人群的早期筛查提供了重要依据[2]。Toll样受体(TLR)是一种进化上高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于巨噬细胞和树突细胞表面，其是一组重要的模式识别受体，在病原体入侵人体时发挥屏障作用。TLR-4与病原体入侵机体的早期免疫应答及感染后的适应性免疫应答相关。研究表明TLR-4是细菌脂多糖的受体，Hp脂多糖可以通过TLR-4诱导致炎因子分泌，通过活化单核细胞和胃上皮细胞诱导一氧化氮和氧自由基，导致胃部炎症及疾病进展[3]。因此，TLR-4与肿瘤特别是炎症相关性肿瘤密切相关。TLR-9主要表达于多种免疫细胞，如记忆性B淋巴细胞、T细胞、浆细胞样树突细胞等，其在多种肿瘤细胞中亦有表达；在胃癌的发生过程中TLR-9介导的炎性反应发挥着重要的作用[4]。有研究指出，TLR-9基因多态性与Hp感染相关，是胃癌潜在易感基因[5]。本研究对江苏省无锡市及安徽省宣城市胃癌及健康人群进行调查，探讨TLR-4及TLR-9基因多态性与胃癌发病风险及病理的相关性，为胃癌的临床及基础研究积累分子流行病学资料，探讨其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2019年12月招募江苏省无锡市及安徽省宣城市经病理确诊的325例胃癌患者(病例组)，以及同期招募该地区经体检检测结果为健康且自述无消化道疾病史的健康者402例(对照组)作为研究对象。

1.2方法 所有受试者均采集乙二胺四乙酸抗凝的静脉血3 mL，分离血浆与血细胞。Hp感染采用胶体金法(上海凯创生物技术公司产品)检测抗体。基因组DNA提取采用纳米磁技术(西安金磁纳米生物技术有限公司产品)按照试剂说明书步骤进行。基因组提取后检测DNA浓度与纯度(NaniDrop2000c型蛋白核酸检测仪，美国Thermo公司)。基因分型采用MassARRAY技术进行(点样仪及质谱仪为美国Sequenom公司产品；Iplex Gold Reagent kit试剂盒为美国Sequenom公司产品)，该平台分析基因型主要为以下步骤：目标序列的扩增、虾碱性磷酸酶纯化、单碱基延伸、树脂纯化、MassArray点样仪、质谱分析、结果解读。PCR所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增仪为美国ABI公司产品(GeneAmp PCR System 9700型)。

1.3多态性位点的选择 在公共数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)检索TLR-4及TLR-9基因多态性位点的信息。基因多态性位点的选择符合以下条件：(1)现有研究显示有潜在的胃癌相关性风险；(2)基因多态性位点在中国人群的最小等位基因频率为大于0.05；(3)基因多态性位点位于TLR-4或TLR-9基因相关区域位置见表1。

表1 TLR-4及TLR-9基因多态性位点信息

2 结 果

2.1两组临床与基本特征比较 两组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)；病例组中吸烟、饮酒比例高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组的Hardy-Weinberg 遗传平衡(HWE)检验结果(P>0.05)显示样本具有群体代表性，见表2。

表2 两组临床资料比较

2.2两组TLR-4、TLR-9基因多态性位点的基因型分布及与胃癌发病风险的关系 TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA、GA/GG基因型与胃癌发病风险相关，见表3。

表3 两组TLR-4、TLR-9基因多态性位点的基因型分布及与胃癌发病风险的关系

续表3 两组TLR-4、TLR-9基因多态性位点的基因型分布及与胃癌发病风险的关系

2.3TLR-9 rs187084基因多态性位点的基因型与胃癌发病风险的相关因素分析 为明确TLR-9 rs187084基因多态性位点的基因型与胃癌发病风险的相关因素之间关系，对年龄、性别、Hp感染、肿瘤部位、肿瘤分期进行分析，结果显示年龄>60岁的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型均与胃癌发病风险相关(P<0.05)，年龄≤60岁胃癌患者的TLR-9 rs187084基因多态性位点的所有基因型均与胃癌发病风险无关。病例组Hp感染阳性患者的TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型均与胃癌发病风险相关(P<0.05)，而病例组Hp感染阴性患者的TLR-9 rs187084基因多态性位点的所有基因型均与胃癌发病风险无关。肿瘤部位为非贲门的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型均与胃癌发病风险相关(P<0.05)。胃癌患者肿瘤分期T3～T4期患者的TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型与胃癌发病风险相关(P<0.05)，见表4。

表4 两组TLR-9 rs187084基因多态性位点的基因型与胃癌发病风险的相关因素分析

3 讨 论

TLR-9 rs187084位点位于该基因的启动子-1 486位，该位点的多态性导致形成转录因子SP1的结合位点[6]，影响了TLR-9表达[7]。研究显示，与浅表性胃炎、萎缩性胃炎及异常增生的患者相比，TLR-9在胃癌患者中呈现高表达，且与Hp感染相关[4，8]。有研究表明，在宫颈癌研究中发现该位点与患者外周血单核细胞中的TLR-9 mRNA及血清中的TLR-9蛋白水平相关，并与人乳头瘤病毒感染关联[9]。本研究结果显示，TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型与胃癌发病风险相关。此外，另有研究进一步证实GA 或GG基因型与胃癌、宫颈癌发病风险相关[10-11]，与本研究结果一致。

本研究发现年龄>60岁的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型均与胃癌发病风险相关(P<0.05)，可能是由于在年龄较大的人群中受到Hp持续感染，暴露时间长，致胃部炎症水平升高，引起TLR-9表达增加，进而增加胃癌的发病风险[12]。胃癌患者肿瘤部位为非贲门的患者TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型均与胃癌发病风险相关(P<0.05)，与TLR-9参与胃癌的发病进程相关机制一致[12]。有研究显示，TLR-9 rs187084基因多态性位点的基因型与胃癌的预后相关，G等位基因与预后较差相关[10]，此与本研究结论一致。本研究结果显示，TLR-9 rs187084基因多态性与胃癌发病风险相关，且与Hp感染有潜在关联，是非贲门胃癌的风险因素，该位点的基因型与胃癌的分期相关，是潜在的预后不良因素。

有研究发现TLR-4 rs10759932基因多态性位点[14]及rs1927911基因多态性位点[15]的基因型与胃癌发病风险相关，与本研究的结论不一致。此可能与病例选择及研究的方法不一样有关，上述两个研究均采用聚合酶链反应-限制性内切酶法，而本研究采用的Mass-array基因分析平台结果相对可靠。还有研究显示TLR-4 rs11536889 的基因型与胃癌发病风险相关[16]，与本研究结论不一致，其所纳入病例相对较少，而本研究病例数虽相对较大，但本研究的病例数统计学效应还较弱，有待于更多的大样本研究进一步证实。胃癌是一个多基因多因素参与的复杂疾病，TLR-9 rs187084基因多态性位点的功能研究还不清晰。

综上所述，年龄>60岁及非贲门部位的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多态性位点的GA及GA/GG基因型均与胃癌发病风险相关。