内质网应激相关因子在脓毒症患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义*

卢 玲，姚 伟△，龚光远

1.重庆医科大学附属第三医院呼吸内科，重庆 401120；2.重庆市綦江区人民医院重症医学科，重庆 401420

目前，脓毒症是造成我国重症监护病房患者死亡的主要原因之一。据估计，全世界每年发生1 800万例脓毒血症[1]。以炎症风暴为特征，进而导致多器官功能损伤及衰竭，是脓毒症发生、发展的病理生理学基础[2]。尽管针对脓毒症的相关研究，近些年已取得了一定进展，但有效的诊断和治疗方法仍相对欠缺。为了降低脓毒症及相关并发症的病死率，更好地明确脓毒症相关的生物学机制至关重要。内质网是负责蛋白质折叠、组装的细胞器，参与了众多生理功能。在应激和炎症状态下，内质网功能受损，引起未折叠的蛋白应答激活，以重建细胞稳态[3]。但内质网中未折叠蛋白长期积聚，触发内质网应激，会引发细胞凋亡。越来越多的证据表明，内质网应激与众多炎症性疾病及恶性肿瘤的发生及发展相关[4-5]。本研究拟观察脓毒症患者外周血单个核细胞(PBMC)中内质网应激相关因子表达水平，并分析其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2020年8月在重庆医科大学附属第三医院(简称本院)就诊的脓毒症患者130例(观察组)为研究对象。观察组男75例、女55例，年龄31～72岁、平均年龄(50.5±13.8)岁，体质量指数(25.0±3.1)kg/m2。纳入标准：(1)年龄>18～75岁；(2)所有患者均满足脓毒症诊治指南[6]：对于感染或疑似感染的患者，脓毒症相关序贯器官衰竭(SOFA)评分较基线上升≥2分。排除标准：(1)数据不完整或不准确的患者；(2)入院24 h内死亡的患者；(3)患慢性疾病的患者如恶性肿瘤、自身免疫性疾病等；(4)近期接受免疫抑制剂治疗的患者；(5)未签署知情同意书的患者。根据观察组患者预后分为存活组(96例)和死亡组(34例)。另选取50例健康志愿者为对照组，均来自同期同一医疗机构的健康体检中心，其中男28例，女22例，年龄32～70岁，平均年龄(51.3±14.0)岁，体质量指数(25.2±3.5)kg/m2，观察组与对照组在性别、年龄、体质量指数等方面比较，差异无统计学意义(P<0.05)。该研究获得本院伦理委员会批准，并征得患者家属知情同意。

1.2方法

1.2.1检测内质网应激相关因子mRNA表达水平 收集所有研究对象外周血3 mL，提取单个核细胞(PBMC)，采用实时定量PCR检测内质网应激相关因子mRNA表达水平。具体检测方法见相关参考文献[7]，简要步骤包括设计引物(引物序列见表1)、RNA提取、逆转录、扩增等。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平。

表1 引物序列

1.2.2检测内质网应激相关基因蛋白表达水平 提取各组PBMC，在RIPA裂解缓冲液中进行冰育裂解20 min，经离心后收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。配置10%电泳液，进行蛋白免疫印迹，检测内质网应激相关蛋白表达水平。具体操作可见参考文献[8]，简要步骤如下：每孔加入等量蛋白，经电泳、转膜、封闭、一抗孵育(抗CHOP抗体和抗ATF-6抗体均为1∶500，抗GAPDH抗体为1∶800)、洗涤、二抗孵育、洗涤及显影等。以GAPDH为内参，计算内质网应激相关蛋白条带与GAPDH灰度比值。

1.2.3检测PBMC中部分炎性和氧化应激指标 收集所有研究对象空腹静脉血3 mL，经抗凝离心后，获取血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定不同组间PBMC中部分炎性指标[白细胞介素(IL)-1β、IL-6]和氧化应激指标[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]水平。具体检测方法见相关试剂盒说明书，炎性指标试剂盒购自南京建成生物公司，氧化应激指标试剂盒购自武汉博士德生物公司。

2 结 果

2.1对照组与观察组PBMC中内质网应激相关因子mRNA及蛋白表达水平比较 与对照组比较，观察组患者PBMC中内质网应激相关因子CHOP和ATF-6 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见表1及图1。

表1 两组外周血内质网应激相关因子mRNA表达水平比较

2.2对照组与观察组PBMC中部分炎性及氧化应激指标水平比较 与对照组比较，观察组PBMC中部分炎性指标IL-1β、IL-6水平和氧化应激指标MDA水平显著升高，而抗氧化应激指标SOD水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组PBMC中部分炎性和氧化应激指标水平比较

2.3不同预后组间PBMC中内质网应激相关因子mRNA和蛋白表达水平比较 与存活组比较，死亡组患者PBMC中内质网应激相关因子CHOP和ATF-6 mRNA及蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同预后组PBMC中内质网应激相关因子mRNA和蛋白表达水平比较

2.4不同预后组PBMC中部分炎性及氧化应激指标水平比较 与存活组比较，死亡组PBMC中部分炎性指标IL-1β、IL-6水平和氧化应激指标MDA水平显著升高，而抗氧化应激指标SOD水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

注：与对照组比较，aP<0.05。

表4 不同预后组PBMC中部分炎性和氧化应激指标水平比较

2.5相关性分析 观察组PBMC中CHOP和ATF-6 mRNA分别与IL-1β(r=0.450，P=0.019；r=0.493，P=0.017)、IL-6(r=0.413，P=0.025；r=0.445，P=0.019)、MDA(r=0.540，P=0.013；r=0.590，P=0.008)水平呈正相关。而与SOD水平呈负相关(r=-0.514，P=0.016；r=-0.499，P=0.017)。

2.6ROC曲线分析 观察组PBMC中CHOP和ATF-6 mRNA的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.852(95%CI：0.775～0.929)和0.840(95%CI：0.755～0.926)，灵敏度分别为77.27%和76.92%，特异度分别为84.91%和79.49%，见图2。

图2 ROC曲线分析

3 讨 论

脓毒症引发众多器官功能不全，造成高致死率，是目前临床面临的重大医学问题。脓毒症发病机制极其复杂，包括炎性反应、免疫功能障碍、线粒体损伤、神经内分泌免疫网络异常、自噬及其他病理生理过程，最终导致器官功能障碍[9]。最近研究表明，内质网应激信号与脓毒症引起的组织细胞死亡有关，在脓毒症细胞及动物模型中，未折叠或错误折叠的蛋白质积聚在内质网中，改变其稳态，导致氧化应激和钙超载，促进内质网应激通路的激活[10]。抑制内质网应激信号，可显著降低脓毒症引起的细胞凋亡，降低炎性反应，改善器官功能[11]。在脓毒症患者人群中，内质网应激相关因子表达水平如何，并且与预后的关系，目前尚未阐明。

研究显示，内质网应激信号通路的激活与多种疾病如糖尿病、高血压、缺血再灌注损伤等发生、发展密切相关[12-14]。抑制内质网应激，可稳定蛋白质构象，促进未折叠或错误折叠的蛋白质转移出内质网，提示抑制内质网应激信号可能是疾病治疗的重要靶点[15]。内质网应激主要包含3条信号通路如CHOP的转录激活，肌醇酶-1及ATF-6激活。脓毒症大鼠中，心脏组织内质网应激主要成分CHOP显著上调，可作用于肿瘤坏死因子受体家族或内质网氧化还原1样蛋白，引起过量的钙离子从内质网运输至线粒体，触发钙依赖型细胞凋亡通路[16]。ATF-6作为内质网未折叠蛋白反应中关键的应激蛋白，当受到压力时被切割为具有转录因子活性的蛋白，并从高尔基体膜转位至细胞核中，激活靶基因的表达，从而参与调控内质网应激反应，维持细胞内蛋白质稳态[17]。在内质网应激状态下，ATF-6过度激活可导致与内质网相互作用的多个膜性细胞器稳态的失衡，包括核膜的皱缩、异染色质的丢失及线粒体结构和膜电势的紊乱，促进半胱氨酸蛋白酶-3凋亡通路激活[18-20]。本研究结果显示，与对照组比较，脓毒症患者PBMC中内质网应激显著激活，同时下游炎性和氧化应激指标显著上调，表明内质网应激促进了下游炎症及氧化应激反应，参与了脓毒症的发生过程。相关研究显示，内质网应激可促进炎症及氧化应激激活，降低大鼠血管舒张反应，升高血压，而给予内质网应激抑制剂处理，可显著逆转上述异常反应[21]。观察组根据脓毒症预后进行分组，研究结果提示，死亡组患者内质网应激及下游通路显著较存活组增强。ROC曲线分析显示，PBMC中内质网应激相关因子(CHOP和ATF-6 mRNA)对脓毒症患者预后的评估价值较高，提示这两项指标具有一定的临床运用价值。内质网应激的激活参与了脓毒症的发生、发展过程，其相关标志物不仅可作为评估脓毒症患者预后的有效指标，还可能为其治疗提供有效的靶点。

脓毒症患者PBMC中内质网应激显著激活，其相关因子可作为评估脓毒症患者预后的有效指标，但脓毒症患者中，内质网应激的上游调控机制尚不清楚，还需动物及细胞实验进一步探索及验证。