烟草TCTP基因克隆与生物信息学分析

王 平，姜轶瑶，杨超群，高梓峰，任雅萍，朴世领

(延边大学农学院，吉林 延吉 13302 )

烟草作为我国重要的经济作物之一，不仅能够解决边远地区农民脱贫问题，同时也大大提高了我国的财政税收[1-2]。但烟草容易发生病虫害，严重影响产量。当烟草感染马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)后，会造成烟株花叶，脉带坏死，植株畸形矮化，严重影响植株的生长发育，这对烟草的产量造成了不可逆的伤害[3-4]。

PVY是一种系统性侵染病害，主要发生在烟株的成长期，在高温条件下也能够保持活性[5]。PVY传播范围广，途径多，但主要通过蚜虫和汁液摩擦进行传播[6]。当正常叶片与病叶产生摩擦，叶片茸毛受到损伤，正常的叶片就容易感染病毒[7]。目前，对烟草PVY的防治非常困难，药剂防治的效果不理想，培育抗病品种是防治病毒最有效的手段。王静静等[8]研究发现，TCTP基因在植物生长发育过程中起着重要作用，它对细胞增殖、分化和再生起着促进作用，能够对抗生物胁迫或非生物胁迫。相关研究表明[9]，在烟草中TCTP能够促进PVY的侵染，蔡健宇等[10]研究发现，在健康的烟草中TCTP定位在细胞核和细胞质中，但在感病的植株中TCTP仅定位在细胞质中，当病毒侵染烟株时，TCTP定位发生改变，可能更利于病毒的侵染。虽然前期研究已经证实TCTP基因在感PVY起重要作用，但尚未在不同抗性材料之间进行该基因的克隆及生物信息学分析。该试验以PVY高抗品种“SY04-3”和高感品种“NC95”为材料，分别克隆出“SY04-3”和“NC95”的TCTP基因，并通过生物信息学手段比较分析两者之间差异，为进一步深入研究烟草TCTP基因对PVY的作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以PVY高感品种“NC95”与高抗品种“SY04-3”为试材，在延边大学农学院温室进行育苗，待烟苗长至3叶期移栽至营养钵中，烟株长至5～6片叶时进行人工接种PVY病毒。病毒叶由延边朝鲜族自治州农业科学院烟草研究所提供，将病叶放入干净的研钵中，加入磷酸缓冲液进行研磨，汁液全部磨出后过滤掉残渣，最后用磷酸缓冲液定容至300 mL，制成PVY病毒液，放在4 ℃冰箱备用。接种时，选取长势一致的烟株，用石英砂在叶片划出伤口，用棉签蘸取病毒液涂抹在伤口，在温室中培养。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取与反转录

接种后48 h从下至上第2片叶进行取样，取样后，加入液氮充分研磨，按照天根生化科技(北京)有限公司的RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取。采用天根生化科技(北京)有限公司的反转录试剂盒并按照说明书进行反转录操作，获得cDNA。将获得的cDNA放在-20 ℃保存。

1.2.2 烟草TCTP基因克隆

采用Primer 5软件设计烟草TCTP特异上游引物为：5′-ATGTTGGTTTATCAGGATCTTCT-3′，下游引物为：5′-TTAACACTTGACCTCCTTGAGT-3′。分别以“SY04-3”和“NC95”的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，PCR程序为94 ℃变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 进行30个循环、之后72 ℃延伸10 min。将PCR 结果凝胶电泳检测，回收后连接pMD19-T，再转化到感受态细胞中，挑取阳性单菌落进行液体培养，后稀释划线。酶切验证正确后送到生工生物工程公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析

采用DNAMAN将测序后得到的cDNA序列进行同源性分析，并对目标序列编码的蛋白质序列进行分析。利用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)在线软件对蛋白质进行理化性质分析。蛋白质亚细胞定位采用在线软件PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)。使用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在线软件对蛋白进行跨膜结构预测。利用SignalP-3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)在线软件蛋白进行信号肽预测。使用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)在线软件对蛋白进行疏水性/亲水性预测。使用在线软件NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行蛋白质磷酸化位点预测。利用YinOYang 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services//)在线软件对蛋白进行O-β-葡萄糖糖基化位点预测。利用在线软件SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)对蛋白二级结构进行分析。利用在线软件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/) 进行蛋白质三级结构分析。通过 NCBI网站中CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd) 对蛋白功能域进行预测。

1.2.4TCTP基因相对表达量

选取长势一致的烟株，在接种后的12、24、72 h进行取样，将取下的叶片迅速包好放入液氮，保存在-70 ℃，送入公司进行转录组检测。以测序结果中的Actin为内参基因，最后采用2-ΔΔCT[11]法计算基因表达量。

2 结果与分析

2.1 烟草TCTP扩增

将提取的RNA进行反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在500 bp左右看到明显的条带(图1)。

将获得的目的基因克隆到大肠杆菌中并进行测序。将测序结果与数据库进行对比发现，“NC95”与已公布的TCTP基因序列(登录号为KM507327.1)一致性为100%，证实所得到的序列为烟草TCTP基因。“NC95”与“SY04-3”的TCTP片段长度都为507 bp，二者均有完整的开放阅读框，编码168个氨基酸。通过DNAMAN 7.0 对“SY04-3”和“NC95”基因序列与蛋白质进行对比，发现二者基因序列存在第206位，227位，260位，313位，317位，485位，500位存在7处碱基突变(图2)，蛋白质序列在第97位存在一个区别，即丝氨基酸(S)变为天冬酰胺(N)(图3)。

2.2 烟草TCTP蛋白理化性质分析

通过Expasy在线软件对烟草蛋白进行蛋白理化性质分析，结果表明：抗病材料“SY04-3”蛋白由168个氨基酸构成，分子质量为18 782.16 kD,等电点(PI)值为4.33；带负电荷残基总数为29，带正电荷残基总数为15，分子式为C848H1299N205O266S5；不稳定指数为23.97，推测这类蛋白为稳定蛋白；脂肪指数为85.83，亲水性总平均值为-0.27。感病材料“NC95”蛋白由168个氨基酸构成，分子质量为18 773.06 kD,等电点(PI)值为4.25；带负电荷残基总数为30，带正电荷残基总数为14，分子式为C845H1292N204O269S5；不稳定指数为24.37，推测这类蛋白为稳定蛋白；脂肪指数为85.83，亲水性总平均值为-0.263。

通过PSORT在线软件对“SY04-3”和“NC95” TCTP蛋白进行分析，结果表明：2个蛋白可能定位在细胞质(图4)。使用TMHMM-2.0在线软件发现2个蛋白均无跨膜结构(图5)。利用SignalP-3.0在线软件对2个蛋白进行预测，结果显示C、Y、S值均小于0.2，不存在信号肽结构，预测该蛋白为非分泌蛋白(图6)，在细胞质合成后无法进行转运。

2.3 烟草TCTP蛋白疏水性/亲水性

使用Protscale在线软件对TCTP蛋白进行预测，结果表明(图 7)，“SY04-3” 和“NC95”的TCTP蛋白在67位和68位氨基酸达到最大疏水性位置，为1.389；在81位和82位氨基酸达到最大亲水性位置，为-2.378，预测该蛋白为亲水性蛋白。

2.4 烟草TCTP蛋白翻译后修饰位点分析

2.4.1 烟草TCTP蛋白磷酸化位点分析

蛋白质磷酸化是一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起着十分重要的作用。使用在线软件NetPhos进行蛋白质磷酸化位点预测(图8)，结果显示“SY04-3”的磷酸化位点有13个，其中，Ser磷酸化位点为Ser9、Ser15、Ser50、Ser81、Ser123、Ser135，共6个；Thr磷酸化位点为Thr21、Thr73、Thr99、Thr140，共4个；Tyr磷酸化位点为Tyr4、Tyr20、Tyr94，共3个。“NC95”的磷酸化位点有14个，较“SY04-3”的磷酸化位点多1个Ser97。磷酸化位点可能对修饰该蛋白的结构或功能起着重要作用，同时也能参与该蛋白的活性调控。

2.4.2 烟草TCTP蛋白糖基化位点分析

利用YinOYang 1.2在线软件对TCTP蛋白进行O-β-葡萄糖糖基化位点预测(图9)，“SY04-3”和“NC95”的糖基化位点只有1个，且位置相同，均为Ser81。

2.5 烟草TCTP蛋白二、三级结构分析与保守结构域分析

2.5.1 烟草TCTP蛋白二、三级结构

利用在线软件SOPMA对TCTP蛋白二级结构进行分析[12]，结果显示，“SY04-3” 蛋白二级结构α螺旋有86个，占51.19%；无规则卷曲有39个，占23.21%；β转角有9个，占6.55%，延伸链有30个，占19.05%；“NC95”蛋白二级结构α螺旋有80个，占47.62%；无规则卷曲有42个，占25.00%；β转角有14个，占8.33%，延伸链有34个，占19.05%(图10)。

通过在线软件SWISS-MODEL对蛋白质三级结构进行预测[13]，预测结构结果如图11。“SY04-3”与“NC95”的碱基不同，存在7出突变，蛋白质序列在第97位由S丝氨基酸变为N天冬酰胺，它们的三级结构有差异。

2.5.2 烟草TCTP蛋白保守结构域

通过 NCBI网站中CDD对TCTP蛋白功能域进行预测。预测结果表明，“SY04-3”和“NC95”蛋白都具有明显的TCTP结构域，该功能域位于1～163位氨基酸之间，是典型的TCTP家族蛋白(图 12)。

2.6 烟草TCTP蛋白进化分析

通过NCBI网站BLAST氨基酸序列对比发现，烟草“SY04-3”蛋白质序列与“NC95”蛋白质序列相似性达到99.40%。在NCBI上选取与TCTP蛋白质序列相似度高的序列，并运用MEGA 7.0软件对烟草(“SY04-3”和“NC95”)、小粒咖啡(XP_027116009.1)、石榴(XP_031381536.1)、睡莲(XP_031499048.1)、丹参(XP_042066744.1)、花生(XP_016174808.1)、茄子(XP_004230244.1)、芝麻(XP_011092087.1)、山茶(XP_028119307.1)、莴苣(XP_023747448.1)、苦瓜(XP_022135588.1)、柑橘(XP_006419560.1)、枣(XP_015875041.1)、辣椒(KAF3643198.1)、二穗短柄草(XP_003577266.1)进行系统进化树构建(图13)，结果表明，烟草与其他植物进化树分为4支，其中，烟草、辣椒、茄子、芝麻为一支；二穗短柄草、丹参为一支；小粒咖啡、莴苣、石榴、山茶为一支；睡莲、花生、苦瓜、柑橘、枣为一支。烟草与茄子和辣椒的亲缘关系最近。

2.7 “NC95”与“SY04-3”不同时期未接种与接种TCTP基因的表达分析

“NC95”和“SY04-3”在不同时期未接种与接种TCTP的表达结果如图 14。在12和72 h时，2个抗感病对照品种的相对表达量之间无显著差异(P>0.05)，而在24 h取样时两者之间有显著差异(P<0.05)。在3个时期，接种处理的感病品种(“NC95”)相对表达量均高于抗病品种(“SY04-3”)，且2个处理之间均有显著差异(P<0.05)。在12、24和72 h感病品种(“NC95”)接种的表达量比未接种分别提高了39.61%、47.69%和38.87%，而抗病品种(“SY04-3”)接种的表达量比未接种分别提高了11.87%、13.61%和7.48%，故感病品种(“NC95”)基因上调幅度大，抗病品种(“SY04-3”)基因上调幅度较小。

3 讨论与结论

TCTP是一种高度保守的蛋白，广泛存在于真核生物中，在哺乳动物中TCTP与许多癌症的发生相关，在植物中最初在紫花苜蓿中克隆出TCTP基因，研究发现TCTP在植物中具有调节细胞生长生殖，抗细胞凋亡，保护细胞抵抗各种逆境胁迫等作用[14-18]。在PVY生物胁迫下，TCTP作为一种抗凋亡蛋白参与超敏反应(HR)，在烟草中TCTP基因的下调促进HR，但TCTP的组成型表达却降低HR，推测在植物的防御过程中TCTP通过调控HR进行参与[19]。

该试验选用PVY高感品种“NC95”和高抗品种“SY04-3”为材料，克隆出的烟草TCTP基因片段为507 bp，在ORF内存在7处碱基替换突变，蛋白质序列存在1处突变，导致蛋白质的三维构象产生改变。“SY04-3”与“NC95”的TCTP所编码的蛋白质分别含有13个磷酸化位点和14个磷酸化位点，都只有1个糖基化位点。烟草TCTP蛋白具有明显的TCTP结构域，属于TCTP家族蛋白，与其他植物同源序列对比发现，氨基酸的相似性较高，可看出TCTP蛋白在植物中功能比较保守。TCTP基因是一种易使烟草感病基因[20]，通过观察接种后不同时期TCTP表达量发现，“SY04-3”与“NC95”在接种后体内TCTP表达量上升，相对表达量都高于对照，但高抗品种“SY04-3”接种前后变化较小，高感品种“NC95”变化较大，这与Bruckner等[21]研究一致。相对表达量的变化表明了TCTP对PVY侵染植株起着一定的作用，但ORF内的7处碱基突变造成蛋白质的三椎构象发生改变是否会影响烟草对PVY的抗性还需要进一步研究。