膜荚黄芪UCGT基因的克隆及表达分析

赵 洋，李俊杰，苏喆莹，李子羊，全雪丽，吴松权*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉133002；2.百泰生物药业有限公司，北京100176)

膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根是常用中药黄芪的来源之一，一直被用作中药的止汗剂、利尿剂或补品。有关药理学和临床实践的研究证实了其具有免疫刺激、强心和抗衰老的活性[1-3]。异黄酮和三萜皂苷被认为是在膜荚黄芪中发现的2种主要生物活性代谢物[4-7]。《中华人民共和国药典(第一部)》规定毛蕊异黄酮葡萄糖苷是其主要活性指标成分之一[1]，具有提供能量、增强免疫系统、促进健康活动和皮肤生长等作用[8-9]。

作为补药之长的黄芪，其需求量随着人们生活水平的提高而越来越大[10]，但目前野生黄芪资源日渐减少，黄芪的活性成分含量也不稳定。因此研究毛蕊异黄酮葡萄糖苷的生物合成规律对于保证黄芪的品质显得尤为重要。在毛蕊异黄酮葡萄糖苷生物合成途径中，以苯丙氨酸解氨酶(PAL)为起始酶，经由苯丙烷代谢途径生成4-香豆酰-辅酶A(4-coumaroyl-CoA)，在通过几种酶合成芒柄花素及毛蕊异黄酮，最后在UDP-毛蕊异黄酮葡萄糖基转移酶(UCGT)的作用下合成毛蕊异黄酮葡萄糖苷[11]。但是，还未发现克隆膜荚黄芪UCGT全长基因的研究表达。该研究以膜荚黄芪为材料，克隆UCGT全长cDNA序列，分析UCGT在不同组织中的表达特性，为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的生物合成机制和调控规律奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄芪药材源自长白山区野生膜荚黄芪，经延边大学农学院植物学教研室石铁源教授鉴定为膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

选取一部分的根、茎、叶，用液氮冷冻处理后置于-80 ℃超低温冰箱中，另一部分样品置于50 ℃恒温干燥箱中烘干至恒定后用于成分分析。

1.2 方法

1.2.1 膜荚黄芪总RNA提取与反转录

参照郎红[12]的方法提取膜荚黄芪根总RNA，具体步骤严格按照Invitrogen 公司的 TRIzol试验说明书，将提取的总RNA保存于-80 ℃超低温冰箱中。将所得总RNA使用超微量紫外分光光度计测定吸光值，分析其纯度及浓度；以膜荚黄芪总RNA 500 ng/μL稀释液为反转录模板，严格按照Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA扩增试剂盒说明书所提供的步骤反转录得到cDNA以及后续5′-RACE与3′-RACE扩增，扩增产物贮存于-80 ℃超低温冰箱中。

1.2.2 膜荚黄芪AmUCGT基因全长克隆

登录NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在GeneBank数据库中下载已登录的拟南芥或者大豆、苜蓿等豆科模式植物甲基转移酶与糖基转移酶基因的核酸序列，用MEGA 6软件对其进行多重序列比对，分析并确定其保守区域；使用Primer Premier 5.1软件设计简并引物AmUCGT ju1和AmUCGT jd1(表1)并扩增。扩增体系为：cDNA 1.0 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、2.5mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、2.5 U ExTaq 0.4 μL、2.0 μmol/L 引物各2.0 μL, 终体积20.0 μL。反应条件为: 94 ℃预变性5 min; 然后进行35个循环, 94 ℃ 40 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 程序循环结束后72 ℃延伸反应10 min。

表1 试验使用的引物

依据扩增测序结果设计5′-RACE扩增特异引物AmUCGT gsp1与3′-RACE扩增特异引物AmUCGT gsp2(表1)，并进行5′-RACE与3′-RACE扩增；依据已克隆的AmUCGT基因的保守序列及5′-RACE和3′-RACE产物序列，利用DNAStar软件进行序列拼接，了解目的基因cDNA全长序列信息，并以此为依据设计了cds特异引物AmUCGT cu1与AmUCGT cd1(表1)扩增AmUCGT基因的ORF，验证目的基因的编码序列。所有过程PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后使用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit进行回收，连接到PMD-18T载体，再转化大肠杆菌JM109感受态细胞，选取阳性克隆菌株送测序。

1.2.3 膜荚黄芪AmUCGT基因的生物信息学分析

NCBI网站进行Blast同源性搜索分析；编码蛋白等电点和分子量预测采用ExPasy在线软件(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)；跨膜结构预测采用TMHMM 2.0 在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；疏水性运用ExPASy ProtScale在线软件(http://expasy.org/tools/protscale.html)；亚细胞定位情况分别用TargetP1.1(http://cbs.dtu.dk/services/TargetP)预测；蛋白质二级结构、三级结构预测分别使用PBIL LYON-GERLANG数据库( https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/)和Swiss-Model (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)在线工具完成；利用MEGA 6软件构建系统发育进化树，分析其在不同物种间进化关系。

1.2.4 膜荚黄芪AmUCGT基因的表达量分析

1.2.4.1 膜荚黄芪不同时期总RNA的提取与cDNA的合成

具体方法参照1.2.1步骤，对膜荚黄芪不同部位样品进行总RNA的提取与cDNA的合成，稀释一倍后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2.4.2AmUCGT基因标准曲线的建立

1) 用超微量紫外分光光度计测定所得AmUCGT的cds质粒浓度，并根据以下公式计算其拷贝数：

2) 将质粒原液10×等梯度稀释至不同浓度，用作模板实时荧光定量PCR，每个样品重复6次。具体反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、cDNA 2.0 μL、Premix (2.0 μM) 2.0 μL，终体积为20.0 μL。

3) 将实时荧光定量PCR所得Ct值为纵坐标，以相应的质粒浓度为横坐标，构建质粒标准曲线。

1.2.4.3 18 s内参基因标准曲线建立与模板定量

1) 18 s内参基因标准曲线建立 以2.4.1步骤所得膜荚黄芪cDNA为模板，通过PCR克隆18 s内参基因(表1)，标准曲线的绘制方法具体参照1.2.4.2步骤。

2) 18 s内参基因模板定量 以1.2.4.1步骤中制备的cDNA为模板，用18 s定量引物(表1)对不同部位的样品进行实时荧光定量PCR，所得Ct值通过18 s标准曲线计算拷贝数，即为18 s内参基因的表达量。

1.2.4.4AmUCGT基因在膜荚黄芪不同器官中表达量分析

以1.2.4.1步骤中制备的cDNA为模板，使用AmUCGT定量引物(表1)进行实时荧光定量PCR，将基因在不同时期未知样品所得Ct值代入相应的标准曲线计算出拷贝数。最终拷贝数与18 s内参基因表达量的比值即基因的表达量，每个样品重复4次。

1.2.5 膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定

膜荚黄芪不同部位毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量采用 HPLC方法[13]进行测定，每组样品的提取和测定操作重复3 次。

1.2.6 统计分析

利用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，多重比较采用 Duncan 新复极差法(P<0.05)，相关性分析采用 Pearson 相关系数。

2 结果与分析

2.1 膜荚黄芪AmUCGT基因的克隆及序列分析

以膜荚黄芪cDNA为模板，使用表1中示出的简并引物AmUCGT ju1与AmUCGT jd1扩增AmUCGT基因的保守区，经切胶回收、T载体连接、转化至大肠杆菌JM109菌株后，获得重组质粒，并对其进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。AmUCGT基因保守区目的片段长度为270 bp左右，测序结果显示，AmUCGT基因保守区目的片段长度为268 bp。

登录NCBI主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用Blast在线搜索工具，将所得的AmUCGT保守区目的片段与其他植物的基因序列进行同源性比较。结果表明，AmUCGT保守区目的片段与豆科植物大豆(NM_001317558)、蒺藜苜蓿(DQ875461)、葛根(EU889120)和鹰嘴豆(KF039764.1)相似性分别为82%、81%、80%和78%；故初步认为所克隆的AmUCGT保守区目的片段为膜荚黄芪UCGT基因片段。

使用膜荚黄芪总RNA反转录合成第1条链，使用表1中的特异引物AmUCGT gsp1、AmUCGT gsp2，以及引物UPM(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)分别进行5′-RACE和3′RACE扩增，并进行质粒PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，可见鉴定结果与PCR产物一致，可将菌液保存并测序。测序结果表明，AmUCGT-5′序列长度为1 207 bp，同源性搜索表明其与豆科植物大豆(NM_001248232.1)、蒺藜苜蓿(DQ875461.1)、鹰嘴豆(KF039763.1)和葛根(XM_007152061)的序列一致性分别为80%、77%、76%和71%；AmUCGT-3’序列长度为952 bp，该序列与豆科植物大豆(NM_001248232.1)、蒺藜苜蓿(DQ875461.1)、鹰嘴豆(KF039763.1)和葛根(KU311041.1)的序列一致性分别为80%、81%、76%和79%。故初步认定AmUCGT-5′与AmUCGT-3′分别为膜荚黄芪UCGT基因的5′端和3′端。

依据测序所得AmUCGT基因保守区域以及5′-RACE和3′-RACE序列，通过DNAStar软件拼接获得AmUCGT基因的全长序列，利用Primer 5软件设计1对编码区特异引物(表1)。以1.2.1步骤所得cDNA第1条链为模板，通过PCR扩增获取目的基因片段，经过回收、连接、转化、提取质粒后进行PCR鉴定(图3)。结果显示，PCR鉴定与拼接所得序列一致，故确定AmUCGT基因的全长序列。

利用DNAStar序列分析软件和NCBI网站的 ORF Finder，ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)等在线分析工具分析AmUCGT全长cDNA序列。结果显示，AmUCGT序列全长1 862 bp，其中，开放阅读框(ORF)1 455 bp，预测其编码484个氨基酸多肽，此外包含5′非翻译区(5′-UTR)为79 bp，3′非翻译区(3′-UTR)为328 bp，包括29 bp的polyA尾；A+T的含量为61.3%，G+C的含量为38.7%。登录NCBI使用Blast在线搜索工具，将所得的膜荚黄芪UCGT基因序列其他植物的基因序列进行同源性比较。分析表明，AmUCGT序列与豆科植物大豆(NM_001248232.1)、葛根(KC473566.1)、蒺藜苜蓿(DQ875461.1)以及鹰嘴豆(KF039763.1)的一致性分别为79%、78%、78%和76%。与豆科其他属植物进行对比时仍发现了较高的一致性，初步说明该研究获得的AmUCGT是膜荚黄芪糖基转移酶序列。

2.2 膜荚黄芪AmUCGT基因的生物信息学分析

利用ExPASy ProtParam在线分析工具预测AmUCGT分子式为C2402H3835N639O718S26，蛋白分子量(MW)为53.99 kDa，理论等电点(pI)为6.52。其中，Leu(11.6%)、Ser(9.7%)、Thr(8.1%)以及Glu(7.0%)等氨基酸残基出现频率较高；在所有氨基酸残基中，带负电荷残基数51，带正电荷残基数48，表明该蛋白呈酸性状态；不稳定系数45.35，表明其属不稳定性蛋白；亲水性均值-0.143，属可溶性蛋白。

为进一步明确AmUCGT的蛋白质特性，采用TMHMM 2.0 在线分析软件进行跨膜结构预测分析(图4)。结果显示，AmUCGT蛋白中未发现预测的跨膜区域，是非跨膜蛋白。利用ExPASy ProtScale在线工具(http://web.expasy.org/protscale/)对AmUCGT蛋白质序列进行疏水性分析(图5)，结果显示，AmUCGT疏水性最强位点在预测肽链37位置的异亮氨酸(Ile)，分值达到2.411，亲水性最强位点在187位置的天冬氨酸(ASP)，为-3.056。此外，AmUCGT亲水性总平均值为-0.143，亲水区域显著大于疏水区域。因此，AmUCGT为亲水性蛋白。使用PRABI在线分析软件与Swiss-Model Workspace在线工具预测AmUCGT二级结构与三级结构，结果显示，AmUCGT蛋白包含240个无规则卷曲，占49.48%，其次为α螺旋171个，链延伸区73个，分别占据35.26%、15.05%，与三级结构的预测结果基本一致。

2.3 膜荚黄芪AmUCGT基因的系统进化分析

为研究AmUCGT与其他物种中糖基转移酶的进化关系，通过MEGA6软件利用最大近邻法构建系统进化树(图6)。系统发育进化树将所选取不同物种的甲基转移酶分为2组，组I中的成员已鉴定具有7-O糖基转移酶活性，其中，包括葛根(A0A067YB04.1)、大豆(BAO79434.1、NP_001304487.1、NP_001235161.1)、赤豆(NP_001316766.1)、彩虹菊(CAB56231.1)、拟南芥(NP_567955.1、NP_197207.1)、甘草(BAC78438.1)、美女樱(Q9ZR25.1)、葡萄(P51094.2)；而组II中成员则分别具有3-O、5-O糖基转移酶的活性，由蝴蝶草(BAC54093.1)、三花龙胆(Q96493.1)、连翘(AAD21086.1)、紫苏(Q9ZR27.1)、烟草(Q9AT54.1)、矮牵牛(BAA89008.1、BAA89009.1)、黄芩(BAA83484.1)组成。在组I中，葛根、大豆以及黄芪等豆科植物中的明显聚为一组，形成豆科植物特有的分支。其中，AmUCGT(ATY39978.1)与GmIF7GT7(NP_001235161.1)聚为一组，GmIF7GT7已被鉴定在大豆中具有在7-O位置糖基化异黄酮的能力，初步表明所鉴定的AmUCGT可能是异黄酮7-O糖基转移酶。

2.4 AmUCGT基因在膜荚黄芪不同器官的差异表达

利用实时荧光定量PCR进一步研究AmUCGT在膜荚黄芪不同器官中的表达(图7)，结果表明：AmUCGT在膜荚黄芪的根、茎和叶中均表达且达到显著水平。其中，根中AmUCGT表达量最高，是叶中表达量的4.1倍，而茎中AmUCGT的表达量为叶中表达量的2.5倍。另测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量在膜荚黄芪的根、茎、叶中的表达量也存在显著差异，其中，根中含量达到了0.29 mg/g，是茎中含量(0.20 mg/g)的1.45倍，而叶中仅含有0.11 mg/g。

3 讨论与结论

UCGT是参与毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成通路中最后一个酶，是研究毛蕊异黄酮葡萄糖苷生物合成的关键基因之一，具有非常重要的生理意义。该研究成功从长白山区膜荚黄芪根中克隆了AmUCGT基因的cDNA序列，全长为1 862 bp，包含1 455 bp的开放阅读框(ORF)，预测其编码484个氨基酸多肽，为可溶性蛋白。系统进化树表明(图6)，AmUCGT与GmIF7GT7聚为一组，GmIF7GT7已被鉴定在大豆中可在7-O位置糖基化异黄酮[14]。这表明克隆的AmUCGT具备糖基转移酶氨基酸典型的结构特征和生物特性。

为了进一步明确膜荚黄芪生长发育过程中毛蕊异黄酮葡萄糖苷生物合成的分子机制，利用实时荧光定量PCR技术研究了AmUCGT基因在膜荚黄芪不同器官组织中的表达量。由图7可知，AmUCGT在根、茎、叶中均表达，且在根中表达量最高，与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量趋于一致，这与李丽[15]报道膜荚黄芪根中毛蕊异黄酮苷含量高于茎和叶的试验结果一致，据此推测AmUCGT参与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的合成。此外,AmUCGT在茎中表达量也较高, 推测膜荚黄芪茎部可能也是毛蕊异黄酮葡萄糖苷重要合成部位。