3种防治草莓灰霉病化学杀菌剂的筛选及复配效果研究

刘华琪 文梦梦 吴小新 薛满满 张晋睿 许洁 郑志天

摘要 [目的]明确不同杀菌剂复配对草莓灰霉病的防治效果。[方法]采用菌丝生长速率抑制法测定咯菌腈、氟硅唑、啶酰菌胺3种化学杀菌剂对淮安地区草莓灰霉病菌的室内毒力。[结果]3种药剂均对草莓灰霉病菌有抑制活性，其中咯菌腈和氟硅唑的抑菌效果最为明显，所测菌株EC 50的平均值分别为0.018 4和0.264 5 μg/mL。将咯菌腈和氟硅唑按照不同比例进行复配，复配剂对草莓灰霉病菌的抑菌活性均表现出相加作用，配比为2∶1和1∶3时相加作用最明显。[结论]咯菌腈和氟硅唑按2∶1或1∶3的比例复配能够延缓抗药性，同时降低农药用量，该复配剂有待进一步研究。

关键词 草莓灰霉病菌;咯菌腈;氟硅唑;化学复配

中图分类号 S 482.2  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）18-0140-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of Three Chemical Fungicides against Strawberry Botrytis cinerea and Study on Synergistic Effect

LIU Hua-qi，WEN Meng-meng，WU Xiao-xin et al （Huaiyin Institute of Technology，Huaian，Jiangsu 223003）

Abstract [Objective]To determine the control effect of three fungicides against strawberry Botrytis cinerea. [Method] The indoor virulence of three chemical fungicides，namely，fludioxonil，fluosilazole and boscalid，to Botrytis cinerea in Huaian Area was determined by mycelium growth rate inhibition method.[Result]All the three agents had inhibitory activity against Botrytis cinerea，among which fludioxonil and fluosilazole had the most obvious inhibitory effect.The average value of EC 50 of the tested strains was 0.018 4 and 0.264 5 μg/mL，respectively.Compounded fludioxonil and fluosilazole in different proportions，and both compounds showed additive effect on bacteriostatic activity of Botrytis cinerea.The additive effect was most obvious when the ratio was 2∶1 and 1∶3.[Conclusion]The combination of fludioxonil and fluosilazole at a ratio of 2∶1 or 1∶3 can delay drug resistance and reduce pesticide dosage.So this compound needs further research and development.

Key words Botrytis cinerea;Fludioxonil;Fluosilazole;Combination of chemical agents

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers）引起草莓灰霉病害是草莓生产上的主要病害。近年来，由于淮安地区草莓的广泛种植，草莓灰霉病的问题日益突出[1-2]。灰霉病主要危害草莓果实，严重时危害果柄、花梗等，每年造成10%～30%的经济损失，严重时甚至高达89% [3-4]。生产上对草莓灰霉病的防控方法主要包括农业防治（清除病残体、调控湿温度、通风透光）、生物防治（枯草芽孢杆菌防治）、化学防治（利用化学农药）等，其中化学防治具有见效快、节约成本等优势，一直是防治草莓灰霉病的主要方法[5-9]。

目前防治草莓灰霉病的化学药剂主要有腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、咯菌腈、啶酰菌胺等，但长期大量使用化学药剂不仅污染土壤，破坏生态结构，还造成农药残留，而且容易使病原菌产生抗药性[10-11]。研究表明，草莓灰霉病菌对腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、咯菌腈等药剂已经产生抗药性，因此选择抑菌效果好，能够延缓药剂使用寿命的复配技术对防治草莓灰霉病显得至关重要[12-15]。该研究选用咯菌腈、氟硅唑、啶酰菌胺3種杀菌剂，进行了室内试验以及复配作用研究，啶酰菌胺是德国巴斯夫公司开发的琥珀酸脱氢酶抑制剂，其作用机制是与病原菌线粒体呼吸链电子传递体系中复合体Ⅱ结合，进而阻碍呼吸能量代谢，抑制 ATP 的合成，使菌体死亡。且对主要经济作物的多种灰霉病、菌核病、白粉病具有良好的保护和治疗作用[16-17]。咯菌腈（fludioxonil）是一种新型的非内吸性苯基吡咯类杀菌剂，咯菌腈的抑菌机制是通过抑制与葡萄糖磷酰化有关的转移酶，使灰霉病菌孢子萌芽、芽管伸长及菌丝体生长受到抑制[18-19]。氟硅唑是三唑类杀菌剂，主要对子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类真菌有效，目前广泛用于果树、蔬菜的黑星病、白粉病、黑斑病、炭疽病、根腐病等[20]，作用原理是破坏和阻止麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜不能形成，从而使病菌死亡。目前发现氟硅唑对草莓灰霉病也具有较好的防治效果[21]。

研究表明，啶酰菌胺与腐霉利、咯菌腈、唑胺菌酯以及嘧霉胺与咯菌腈的復配剂对草莓灰霉病的防治均有增效作用[22-25]。笔者将咯菌腈和氟硅唑进行不同比例复配，测定其联合毒力，为草莓灰霉病防治减药增效，延缓抗药性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株。

草莓灰霉病野生菌株（Botrytis cinerea）Bc1和Bc9，由笔者所在课题组从淮安地区各大草莓园发病的草莓病果上分离、纯化和培养获得。

1.1.2 试验药剂。

98.51%啶酰菌胺原药（上海秦巴化工股份有限责任公司）;97.9%咯菌腈原药（江苏杨农化工集团有限公司）;97%的氟硅唑（南京农业大学杀菌剂实验室）。

甲醇，分析纯，分别溶解咯菌腈、氟硅唑和啶酰菌胺原药，均配成浓度为1×104 μg/mL的母液，再用甲醇稀释成系列质量浓度的药液供试 （表 1）。

1.2 试验方法

1.2.1 室内毒力测定。采用菌丝生长速率法测定药剂对草莓灰霉病菌的抑制作用。首先按照表1制作不同药剂浓度的PDA平板，同时设无药平板为对照。用打孔器在预培养4 d的草莓菌Bc1、Bc9菌落边缘打取菌碟，正面朝下接种到含药平板上，每个处理重复3次，置于27 ℃培养箱黑暗培养。5 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝抑制率，并采用浙大DPS V9.01数据处理系统进行生物测定分析，求出单剂的毒力回归方程、抑制中浓度EC 50及相关系数r。试验进行2次。

抑制率=（对照组菌落直径-含药组菌落直径）/对照组菌落直径×100%

根据上述试验结果选出毒力较高的咯菌腈和氟硅唑，按照比例混合法进行复配，然后采用菌丝生长速率法对草莓灰霉病菌继续进行生物测定。先将咯菌腈和氟硅唑母液按照体积比1∶1、2∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12进行复配，再按照表1制备成含药平板，以无药平板为对照，用菌丝生长速率法进行测定。得出各复配组合的EC 50值，并采用Wadley法进行复配增效作用评价[26]。

EC 50（th）=（a+b）/[a/EC （A）50+b/EC （B）50]

SR= EC 50（th）/EC 50（ob）

式中，A、B分别代表2种药剂，a、b分别代表2种药剂在混剂中所占比例，ob为实际观察值，th为理论值。当增效系数SR>1.5时为增效作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR<0.5为拮抗作用。

1.2.2 离体草莓叶片试验。首先在温室中培养健康的易感灰霉病的“红颜”草莓，选取健康的大叶片用清水洗净，分别浸泡在浓度为0.26 μg/mL的不同杀菌剂培养皿中10 min，4组杀菌剂分别为咯菌腈、氟硅唑单剂、2∶1和1∶3的咯菌腈与氟硅唑的复配剂，对照组浸泡在无菌清水中。然后将叶片正面向上置于直径9 cm铺有润湿滤纸的培养皿中，每个培养皿中放一片叶片。然后将预培养4 d的草莓菌Bc1、Bc9菌落边缘打取菌碟，正面朝下接种到叶片正中央并在叶片中央做伤口处理。每个处理重复5个叶片，用封口膜封培养皿于培养箱中 27 ℃光暗交替（光∶暗=12 h∶12 h）培养。每隔2 d用移液枪加0.26 μg/mL浓度的药液于滤纸片上保持滤纸湿润，对照组加无菌水湿润。7 d后，待清水对照充分发病后调查各处理发病情况。

1.3 数据分析 原始数据经 Excel 软件进行初步处理，采用DPS V 9.01 软件的专业统计方法对室内毒力数据进行生物测定分析，获得药剂的 EC 50、回归方程以及相关系数;用Photoshop软件对发病叶片进行处理。

2 结果与分析

2.1 3种杀菌剂对草莓灰霉病的毒力测定

由表2可知，咯菌腈对草莓灰霉菌菌丝生长抑制最强，其EC 50的平均值为0.018 4 μg/mL;其次为氟硅唑，其EC 50的平均值为0.264 5 μg/mL;啶酰菌胺略低于氟硅唑，其EC 50的平均值为0.514 7 μg/mL。因此，选用咯菌腈和氟硅唑进行下一步复配研究。

2.2 咯菌腈、氟硅唑对草莓灰霉病菌的复配比例筛选

咯菌腈是防治草莓灰霉病的特效药剂，近年来，随着咯菌腈的大量使用，田间已经出现对咯菌腈有抗性的草莓灰霉病菌株[27]。而氟硅唑通常认为防治子囊菌效果较好，Wang等[21]发现，氟硅唑对草莓灰霉病也具有良好的防治效果，且田间没有抗药性菌株出现。因此，该研究对咯菌腈和氟硅唑进行复配，以期达到延缓咯菌腈抗药性的发生。由表3可知，不同配比的咯菌腈和氟硅唑复配剂均对草莓灰霉菌有抑制效果，EC 50在0.033～0.210。由于咯菌腈的毒力高于氟硅唑，其抑制中浓度远低于氟硅唑。为了减少咯菌腈的使用量达到延缓抗药性的目的，在复配物中提高氟硅唑所占的比例，几乎所用的复配剂均表现为相加作用。尤其当咯菌腈与氟硅唑以2∶1和1∶3复配时，增效系数最高，相加作用最明显。

2.3 草莓离体叶片防效

对筛选出来的药剂和复配比例进行了草莓离体叶片试验，用草莓灰霉病菌Bc1和Bc9对氟硅唑的平均EC 50 值0.26 μg/mL 处理草莓叶片，观察不同药剂与不同复配比例对草莓灰霉病菌的防治效果。从图1可以看出，接种草莓叶片7 d后，未用药剂处理的叶片变黑，表面凹陷腐烂，产生白色菌丝，病斑占整个叶片3/4以上。而用0.26 μg/mL咯菌腈处理的叶片，仅在接种伤口部位有轻微的褐色病斑，说明咯菌腈对草莓灰霉病的防效最好。用0.26  μg/mL氟硅唑处理的叶片，病斑大小接近叶片的1/2，符合中浓度抑制效果。咯菌腈与氟硅唑按2∶1和1∶3复配剂处理结果表明，病斑大小占整个草莓叶片的1/4～1/3，也具有相当好的防治效果，且该复配剂对延缓草莓灰霉病对咯菌腈的抗药性、减少草莓生产上对咯菌腈的依赖具有重要意义。

3 结论与讨论

草莓灰霉病菌繁殖速度快，寄主范圍广，对环境适应性强，是高抗风险的病原物，已对多种农药产生抗药性[28]。而将杀菌剂进行混配可明显降低草莓灰霉病抗药性群体的形成，同时还具有扩大杀菌谱、增强药效、减少农药用量、降低成本等优点。单一使用咯菌腈对草莓灰霉病具有极好的防治效果，其EC 50为0.018 4 μg/mL左右，但田间已经出现抗药性菌株，使得该药剂的持续施用具有较大风险。而氟硅唑是三唑类杀菌剂，主要对子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类真菌有效，目前广泛用于果树、蔬菜的黑星病、白粉病、黑斑病、炭疽病、根腐病等方面。该研究表明，氟硅唑对草莓灰霉病也具有良好的防治效果，其EC 50在0.264 5 μg/mL左右。

该试验首次将作用机理不同的咯菌腈和氟硅唑药剂进行复配，结果表明不同复配比例的咯菌腈和氟硅唑对草莓灰霉病均具有良好的抑制效果，增效作用均为相加作用，尤其以质量比2∶1和1∶3的复配对草莓灰霉病的相加作用最明显，离体草莓叶片试验也证明该复配比例的有效性。该结果不仅有助于延长2种药剂的使用寿命，而且增加了防治草莓灰霉病的新药剂，建议生产上推广应用。

该试验仅研究了咯菌腈和氟硅唑复配物对草莓灰霉病的防治效果，而这2种药剂对其他病原菌，如油菜菌核病菌、草莓白粉病、草莓炭疽病是否也具有良好的防治作用，值得进一步研究。因为氟硅唑成分对子囊菌纲具有抑制作用，推测其对草莓白粉病及草莓炭疽病也具有防治效果。则该复配剂将一次性解决草莓生产上的三大病害，即草莓灰霉病、草莓白粉病及草莓炭疽病，使得该混剂既解决草莓生产上抗药性难题，也解决了草莓病害难以防治、草莓生产用药量大等问题，对草莓生产减药增效、保护环境具有重大意义。

参考文献

[1]

陈丽萍，吴长兴，苍涛，等.8种杀菌剂对草莓灰霉病菌的室内毒力[J].浙江农业科学，2018，59（9）：1535-1537.

[2] 肖婷，吉沐祥，杨敬辉，等.不同药剂处理对草莓植株抗病性的影响[C]//中国植物保护学会.病虫害绿色防控与农产品质量安全——中国植物保护学会2015年学术年会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，2015.

[3] 张晓慧.草莓病害研究进展[J].安徽农学通报，2018，24（18）：52-57.

[4] 张国珍，钟珊.草莓灰霉病研究进展[J].植物保护，2018，44（2）：1-10.

[5] ROSSLENBROICH H J，STUEBLER D.Botrytis cinerea-history of chemical control and novel fungicides for its management[J].Crop protection，2000，19（8/9/10）：557-561.

[6] HUANG R，CHE H J，ZHANG J，et al.Evaluation of Sporidiobolus pararoseus strain YCXT3 as biocontrol agent of Botrytis cinerea on post-harvest strawberry fruits[J].Biological control，2012，62（1）：53-63.

[7] 吉沐祥，李国平，杨敬辉，等.江苏省设施草莓病虫害绿色防控技术规程[J].江苏农业科学，2013，41（8）：119-121.

[8] SHAO W Y，REN W C，ZHANG Y，et al.Baseline sensitivity of natural populations and characterization of resistant strains of Botrytis cinerea to fluazinam[J].Australasian plant pathology，2015，44（4）：375-383.

[9] Aqueveque P，Céspedes C L，Alarcón J，et al.Antifungal activities of extracts produced by liquid fermentations of Chilean Stereum species agains Botrytis cinerea（grey mould agent）[J].Crop protection，2016，89：95-100.

[10] ZHANG C Q，HU J L，WEI F L，et al.Evolution of resistance to different classes of fungicides in Botrytis cinerea from greenhouse vegetables in eastern China [J].Phytoparasitica，2009，37（4）：351-359.

[11] SUN H Y，WANG H C，CHEN Y，et al.Multiple resistance of Botrytis cinerea from vegetable crops to carbendazim，diethofencarb，procymidone，and pyrimethanil in China [J].Plant disease，2010，94（5）：551-556.

[12] 张佳，张璨，芦帆，等.草莓灰霉病菌对嘧菌酯的抗性检测及抗性菌株的生物学特性研究[J].植物病理学报，2016，46（1）： 124-130.

[13] 陈仁，陈群航，杜宜新，等.福州地区灰霉病菌对腐霉利和嘧霉胺抗药性测定[J].福建农业学报，2015，30（2）：180-183.

[14] 韩巨才，刘慧平，闫秀琴，等.灰霉病菌对三种杀菌剂的抗性表现型分布及稳定性测定[J].农药学学报，2004，6（3）：43-47.

[15] 白耀博，陈学进，凤舞剑，等.徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性[J].安徽农业科学，2016，44（35）：162-164.

[16] 亦冰.新颖杀菌剂——啶酰菌胺[J].世界农药，2006，28（5）：51-53.

[17] 颜范勇，刘冬青，司马利锋，等.新型烟酰胺类杀菌剂—— 啶酰菌胺[J].农药，2008，47（2）：132-135.

[18] 赵虎，王松群，余新燕，等.南京、镇江地区草莓灰霉病菌对6种杀菌剂的抗药性及生物学性状分析[J].基因组学与应用生物学，2016，35（7）：1828-1834.

[19] 杨玉柱，焦必宁.新型杀菌剂咯菌腈研究进展[J].现代农药， 2007，6（5）：35-39.

[20] 宋善興，付娟娟，贾松峰，等.2种氟硅唑药剂防治辣椒白粉病的效果[J].长江蔬菜，2020（5）：64-65.

[21] WANG Y，WANG M M，XU L T，et al.Baseline sensitivity and toxic action of the sterol demethylation inhibitor flusilazole against Botrytis cinerea[J].Plant disease，2020，104（11）：2986-2993.

[22] 王翀.啶酰菌胺和腐霉利复配对草莓灰霉病菌的联合毒力及增效作用[J].农药，2018，57（6）：461-464.

[23] 张锐.啶酰菌胺与嘧霉胺的复配对黄瓜灰霉病的防治效果研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2017.

[24] 张亚，刘青，刘双清，等.啶酰菌胺和咯菌腈复配对草莓灰霉病菌的室内毒力测定及田间防效[J].中国蔬菜，2018（2）：53-57.

[25] 赵建江，陈治芳，韩秀英，等.啶酰菌胺与唑胺菌酯混配对灰葡萄孢毒力的增效作用[J].农药学学报，2015，17（4）：417-424.

[26] 农业部农药检定所.农药室内生物测定试验准则 杀菌剂 第 6 部分：混配的联合作用测定：NY/T1156.6—2006[S].北京：中国农业出版社，2006：1-3.

[27] SANG C W，REN W C，WANG J J，et al.Detection and fitness comparison of target-based highly fludioxonil-resistant isolates of Botrytis cinerea from strawberry and cucumber in China[J].Pesticide biochemistry and physiology，2018，147：110-118.

[28] 陈治芳，王文桥，韩秀英，等.灰霉病化学防治及抗药性研究进展[J].河北农业科学，2010，14（8）：19-23.