二代测序在脓毒症患者病原学检测中的应用价值

许小泽 黄泽伟 刘振密 肖卫民 苏 阗 黄瑞坤 赵崇涛 刘雪燕▲

1.暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）重症医学科，广东深圳 518020；2.深圳市泰康吉音生物科技研发服务有限公司技术部，广东深圳 518000

脓毒症是指因感染引起的宿主免疫反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]，其起病急、进展快、病原体复杂，可导致全身多器官功能障碍乃至迅速衰竭，短时间内能否明确致病病原微生物对指导治疗和改善预后具有重大意义。目前，临床工作中常用病原体检测方法主要为传统微生物培养，存在培养时间长、检出率低、覆盖面小等缺陷[2]，无法满足脓毒症患者进行靶向抗菌治疗的亟需性。二代测序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）技术为新型病原检测手段，具有快速、阳性率高、覆盖面广等优势，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断[3]，但临床中尚未广泛使用。本研究通过比较分析mNGS 与传统血培养两种病原检测方法的病原体检出率，进一步分析抽样前有无使用抗生素对两者的检出影响，旨在为明确mNGS 在脓毒症患者中的应用价值提供一定的科学证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月—2019年9月深圳市人民医院重症医学科收治的118 例脓毒症患者进行回顾性分析，收集研究对象的一般信息（包括住院号、姓名、性别等等）、诊断、入科时急性生理学与慢性健康状况系统评估Ⅱ（systematic assessment of acute physiology and chronic health conditions，APACHE Ⅱ）评分、序贯器官衰竭（sequential organ failure，SOFA）评分、感染部位、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、中性粒细胞比例（neutrophil ratio，Neu%）、C-反应蛋白（Creactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、乳酸（lactic acid，Lac）、入科前有无使用抗生素、治疗过程中是否使用血液净化及呼吸机、28 d 预后情况、院内血浆微生物培养结果、Mngs 报告等。纳入标准：①年龄≥18 岁；②脓毒症诊断符合Sepsis-3[1]中的诊断标准；③入科24 h 内有留取血浆样本进行微生物培养及二代测序检验；④患者或其家属已签署知情同意书。排除标准：①入科后24 h 内自动出院或死亡患者；②血浆样品受到污染；③病例数据不全。本研究符合医学伦理学标准，研究方案经深圳市人民医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 血培养 采用梅里埃BacT/ALERT 3D120 全自动血培养仪进行血液微生物培养，严格按照该仪器说明书步骤进行操作，同时需注意以下几点。①采血时机：入科24 h 内采血，尽可能地在抗菌药物使用前采血，寒战和发热初起时采血；②采集方法：确保医护人员手卫生，确保血培养瓶合格并在有效期内且无破损，对患者皮肤进行严格仔细消毒处理，规范进针采血，血液注入培养瓶后轻摇以防血液凝固；③标本运送：确保取样后2 h 内标本送检。1.2.2 mNGS 检测流程 留取血浆样品，无菌条件下送往深圳泰康吉音生物科技研发服务有限公司进行mNGS 病原体检测，主要方法及步骤：游离DNA 的提取（按照QIAGEN QIAamp UltraSens Virus Kit 的标准流程操作）→末端补平DNA（使用的建库试剂盒为Ion Plus Fragment Library Kit，补平DNA 取值50～100 ng）→使用试剂纯化补平的DNA，并做片段选择→连接接头，缺口平移→使用试剂纯化连接后的DNA→文库扩增→使用试剂纯化DNA→文库检测→上传分析→生成报告。主要材料来自赛默飞LIFE，具体名称及货号见表1。

表1 mNGS 主要材料

1.3 观察指标及评价标准

描述研究对象的临床特征及预后信息、mNGS 与微生物血培养的病原体检出情况，比较分析两者的差异性。以微生物血培养作为菌血症的金标准，当检验到细菌或真菌时认为样本阳性，计算mNGS 的灵敏度、特异性、约登指数，进一步比较分析抗生素的使用与否对两者方法的检测影响，综合分析讨论mNGS在临床诊治中的应用价值。灵敏度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%，特异性=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%，约登指数=灵敏度+特异性-1。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析，正态分布的连续变量以均值±标准差（±s）表示，采用Mc-Nemar χ2检验进行病原体阳性检测率的比对分析，采用Chi-square χ2检验分析抗生素对病原体的检测影响，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征及预后

纳入的118 例患者均符合Sepsis-3 的脓毒症诊断标准，其中脓毒症61 例（51.69%），脓毒性休克57例（48.30%）；平均年龄为（59.14±18.78）岁，入住深圳市人民医院重症医学科时APACHEⅡ评分为（18.33±7.66）分，SOFA 评分为（8.83±4.00）分。主要感染部位分布中，肺部感染50 例（42.37%），腹部感染37 例（31.36%），泌尿系感染14 例（11.86%），其他部分感染17 例（14.41%）。入科时即刻测得WBC 为（13.31±9.48）×109/L，Neu%为（85.39±14.29）%，CRP 为（165.36±117.94）mg/dL，PCT 为（61.31±76.25）ng/mL，Lac 为（4.78±5.06）mmol/L。入科前有87 例（73.73%）患者已使用过抗生素。治疗期间，有46 例（38.98%）患者使用血液净化治疗，78 例（66.10%）患者需要呼吸机辅助通气。28 d 死亡率为30.51%（36 例）。

2.2 病原体检出情况

mNGS 病原体检出率为35.59%，明显高于微生物血培养的检出率（16.10%），差异有统计学意义（P=0.000），具体见表2。进一步计算mNGS 的灵敏度、特异性、约登指数，分别为78.95%、72.73%、51.68%。在病原体检出分布方面，本研究结果显示，mNGS 不仅能检出细菌、真菌，还能鉴别出病毒、衣原体等病原体，具有更广的覆盖面，具体见图1（封四）。

表2 微生物培养和mNGS 的血浆样品病原体检出情况

图1 病原体的检出分布图

2.3 抗生素对病原体的检测影响

对于微生物血培养，若在入科前已使用抗生素，其检出率较尚未使用抗生素明显减低（9.19%vs.35.48%，χ2=9.827，P=0.002）；而是否使用抗生素对mNGS 在病原体方面的检出率影响差异无统计学意义（37.9%vs.29.03%，χ2=0.790，P=0.374）。另外，入科前已经使用抗生素的87 例患者中，mNGS 的检出率明显高于微生物培养（37.9%vs.9.19%，P=0.000）；入科前尚未使用抗生素的31 例患者中，两种方法的检出率比较，差异无统计学意义（29.03%vs.35.48%，P=0.687）（表3）。

表3 有无抗生素对病原体的检测影响

3 讨论

脓毒症和脓毒性休克是急危重症医学面临的重要临床问题，全球每年脓毒症患病人数超过1900 万，其中有600 万患者死亡，病死率超过1/4，存活的患者中约有300 万人存在认知功能障碍[4-6]。治疗时间窗在脓毒症患者的治疗中至关重要，早期治疗（包括抗生素管理和感染源控制）是决定性的第一步，可以极大地影响患者的治疗及预后情况[7]。当前的指南建议尽早开始抗菌治疗，最好在确认脓毒症后1 h 内启动静脉抗菌药物治疗[8]。但是，大多数早期治疗都是经验性的，并且有46%的经验性抗生素治疗是不合适的，更有35%的死亡率与之相关[9]。据报道，大约50%的经验性治疗是不必要的，或者范围太广，增加了耐药性和毒性的风险[10]。因此，早期识别脓毒症患者感染病原体并进行靶向抗菌治疗对改善患者的结局至关重要。大量研究也反复强调早期病原体识别是抗生素靶向有效治疗的关键[11]。然而在许多临床诊治中，确定病原体仍具有挑战性，许多常见的病原体很难或者根本无法在体外培养[12]，若是深部的感染通常需要对感染组织进行侵入性活检才能做出诊断[13]。

长期以来，微生物培养是诊断病原体最常规的技术，也一直是指导脓毒症抗生素使用的重要依据，但该技术存在不少缺陷，临床实验室一般只能进行细菌或真菌的培养。本研究纳入的118 例患者中，血培养结果显示也是局限于细菌和真菌的回报，并且培养周期较长（3～7 d），阳性率偏低，受抗生素的使用影响较大，存在较高的假阴性可能[14]。虽然可以通过反复多次送检提高阳性率，但往往会延误正确治疗的最佳时机，特别是在面对脓毒性休克的迅速进展时。基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的病原学检测技术具有极高的灵敏度及特异性，并可在一定程度上加快病原体的鉴定速度，但其只能对已知病原微生物进行检测，在选择检测之前需要进行推定性诊断，无法完成高通量筛查，整体检出率亦偏低[15]。免疫学方法（包括免疫荧光、ELISA、补体结合试验等等）在病原体判断方面具有操作简单的便捷性以及极高的特异性，但由于病原体种类繁多（据报道，已知有高达1000 多种微生物可感染人类），目前研发的抗原抗体数量远不及临床需要。另外，WBC、Neu%、CRP、PCT、Lac 等生化指标虽可在脓毒症的早期诊断方面具有一定的参考价值，但特异性不高，更是无法明确具体病原体，对于选择抗生素的指导性不强[16]。因此，为解决早期明确脓毒症患者感染病原体的问题，寻找一种时效快、敏感度高、特异性强、覆盖面广的诊断技术迫在眉睫。本研究所使用的mNGS 技术来自于泰康吉音生物科技研发服务有限公司，是基于二代高通量测序平台产品的序列数据，无需特异性扩增[10]，可直接通过微生物专用数据库进行比对分析，经过智能化算法获得疑似致病微生物的种属信息，并提供全面深入的报告参数辅助临床诊疗决策。此技术针对血流感染、神经系统感染、呼吸道感染及消化道感染症候群，可检测60 000 余种微生物，包括细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体等，辅助临床医生制订精准诊疗方案。

本研究纳入的118 例研究对象的临床资料显示，患者平均年龄达到（59.14±18.78）岁，70 岁以上更是占33.9%（40/118），提示老年人是脓毒症患者的主要群体，这也是与老年人本身基础情况偏差有关。在主要感染部位分布方面，肺部（42.37%）感染为主，其次是腹部（31.36%）感染，与近年来国内外研究结果基本一致。入科时即刻测得的WBC 为（13.31±9.48）×109/L，Nec%为（85.39±14.29）%，CRP 为（165.36±117.94）mg/dL，PCT 为（61.31±76.25）ng/mL，Lac 为（4.78±5.06）mmol/L，均较正常值明显升高，提示处于重症感染状态，需要尽早行靶向抗感染控制。在治疗方面，有46 例（38.98%）患者使用血液净化治疗，78 例（66.10%）患者需要呼吸机辅助通气。在28 d 预后方面，有36 例（30.51%）患者死亡，与近年来国际相关研究报道的脓毒症死亡率基本一致[17]。

在病原体检出方面，早期Long 等[18]在北京协和医院纳入78 例脓毒症患者血样行普通血培养和mNGS 研究，结果显示mNGS 可显著提高病原体的检出率（30.77%vs.12.82%）。本研究结果显示，mNGS病原体检出率为35.59%，高于微生物血培养的检出率（16.10%）（P=0.000）。同时，若以微生物血培养作为菌血症的金标准，当检验到细菌或真菌时本研究认为样本阳性。本研究中，mNGS 的灵敏度、特异性、约登指数分别为78.95%、72.73%、51.68%，提示mNGS 不仅可提高脓毒症的病原体检出率，更是具有较高的灵敏度和特异性。在检测结果回报的时间方面，本研究没有详细记录从样本采集、样本寄送到样本核酸开始提取这段时间，而深圳泰康吉音生物科技研发服务有限公司进行mNGS 病原体检测的总时间为（32±4）h，短于传统微生物培养时间，往后可以在样本采集及样本寄送步骤方面加快效率，争取更短的时间得到mNGS 的结果。既往关于脓毒症流行病学的调查报道显示[19]，脓毒症最常见的病原菌为G-菌，约占58%；其次为G+菌、真菌等，这与本研究的结果基本一致。微生物培养中，G-菌、G+菌、真菌分别为63.16%、21.05%、15.79%；而mNGS 结果中，G-菌为56.87%，G+菌为27.45%，真菌为1.96%，病毒为9.80%，衣原体为3.92%，提示mNGS 在病原体检测方面具有更广的覆盖面，可以检测到血培养无法培养的如病毒、衣原体等更多种类的微生物，Decker 等[20]和Piantadosi 等[21]的研究报告也进一步证明了mNGS 可检测到更多的特殊病原体。此外，关于检出的具体病原学分布中，本研究显示“肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌”占据比例最多，这与李翠翠等[22]、刘艳君等[23]在血流感染病原菌的调查研究中的结果相似。进一步观察，本研究显示mNGS 在“肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌”的阳性回报绝对量远远高于血培养，具体序列数较其他病原菌也呈现高表达，提示mNGS 在不同病原体的检出性能方面具有一定的差异性，所以在拟定阳性病原体序列数界值方面要尽量做到个性化，这也是本课题组接下来的进一步研究。最值得关注的是，本研究发现抽样前使用抗生素对mNGS 的检出率影响较小（37.90%vs.29.03%，P=0.374），但能够明显降低微生物培养的检出率（9.19%vs.35.48%，P=0.002）。另外，单独分析87 例抽样前已使用抗生素的患者，本研究发现有25 例患者通过mNGS 可以检测出相关病原体，而微生物培养为阴性；在仅有的8 例微生物培养阳性患者中，均有对应的mNGS 阳性结果，这可能与mNGS 的测序原理相关。因为即使被抗生素杀灭后的部分病原体仍可释放核酸，仍可被提取检测出来，从而提高了mNGS 的灵敏度。

综上所述，mNGS 在脓毒症中具有一定的应用价值，可明显提高病原体的检出率，缩短检测时间，在病原学的诊断方面具有较高的灵敏度、特异性，更是具有广覆盖的特性，受抗生素的影响较小。因此，笔者建议将mNGS 技术广泛应用于脓毒症的临床诊治中，力争做到针对病原菌的早期靶向干预，改善预后。