蔷薇属黑斑病抗性与叶片结构及酶活性研究

郭艳红，张 颢，陈宇春，蹇洪英，陈 敏，唐开学，邱显钦

(1.云南省农业科学院花卉研究所，云南 昆明 650205；2.云南大学生命科学学院，云南 昆明 650091；3国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650205)

【研究意义】月季(Rosahybrid)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)的植物，是中国十大名花之一的“花中皇后”，世界四大鲜切花之一，具有极高的观赏价值[1]。蔷薇盘二孢及细极链格孢(Alternariatenuisima)侵染会引发月季黑斑病[2]，主要病理表现在月季叶片、嫩茎、花梗等部位。叶片染病初期，正面出现黑褐色小斑点，随着染病病情的加重，黑褐色逐渐变为暗褐色，斑点不断扩大，一般表现为不规则或圆形的病斑，借助雨水、风以及昆虫传染到其它叶片上，其病害严重时会引起叶片大量脱落，甚至导致月季死亡[3]。嫩茎和花梗染病后，病斑呈现出紫黑色的条形或长椭圆形的斑点，病斑会下陷。现代月季种非常丰富，日常生活随处可见，但黑斑病病原菌容易产生各类生理小种，降低月季的抗病性，进而影响月季的产量及观赏性，因此急需引入更优良的蔷薇遗传资源[4]。中国蔷薇属野生资源十分丰富，调查显示：中国蔷薇属野生种质资源，约占全球总数的48%，其中有近50%的资源集中在中国西南地区[5]。而众多的野生蔷薇属优秀种质资源目前抗病研究匮乏，较少被开发利用[6]。【前人研究进展】目前对于黑斑病的抗性鉴定主要集中在核桃(Caryacathayensis)、黄瓜(Cucumissativus)、甘薯(Dioscoreaesculenta)以及胡萝卜(Daucuscarotavar.sativa)等作物[7]上。张雪辉等[8]发现红衣主教、大卫、萨曼莎等现代月季高抗品种可有效抵御黑斑病；王琼[8]找到了篝火、金玛丽、洛丽塔、芳纯4个高抗品种。采用抗病品种是防治植物病害最经济的方法之一，抗病性鉴定和抗病种质资源的筛选是抗病育种的基础。柳丽娜等[9]对不同茶用菊品种进行电镜扫描，发现抗病品种表皮毛密度普遍高于感病品种，气孔密度小于感病品种。徐东生[10]发现月季抗病品种嫩叶SOD活性高于感病品种；与老叶相比，病叶SOD、PPO活性上升，POD活性有降有升。【本研究切入点】以云南省农科院雨树村花卉基地46份蔷薇属野生种为材料，对叶片发病率、病情指数以及相对病情指数等进行分析，最后利用相对抗病性指数进行综合评价。筛选免疫与高感野生种，测定SOD、PPO、POD酶活性并对叶表皮结构应用扫描电子显微镜进行观察。【拟解决的关键问题】通过评价蔷薇属野生种质资源对黑斑病的抗病性，筛选具有优良抗病基因的蔷薇属植物种质资源，不仅为培育具有黑斑病抗性的月季新品种奠定理论基础，并且具有重要的生态意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

月季由云南省农科院雨树村花卉基地的芹叶组、蔷薇组和桂味组等9个组提供共计46份野生种(表1)。黑斑病菌源采自云南省农科院雨树村花卉基地大棚。

1.2 试验方法

1.2.1 黑斑病的分离、纯化 采集具有明显黑斑病症状的野生月季病叶，后用清水洗净，接着用次氯酸钠消毒2 min，再用无菌蒸馏水冲洗4次，2次重复。吸去表面水分，沿着病斑将病叶切成小块，移至PDA平板，置于温度25 ℃培养箱中恒温培养。2 d后，挑取菌丝，移到PDA平板上，继续放于25 ℃培养箱中培养。培养5 d，孢子大量产生时，挑取单孢子置于PDA平板培养基上25 ℃继续培养。7～10 d后，将培养的月季黑斑病菌落挑至试管中，经消毒的解剖针捣碎，加入适量的无菌水，混匀，静置5～8 min，保留上清液，镜检并调成孢子含量为2×105mL-1的孢子悬浮液，待用。

1.2.2 黑斑病抗性室内鉴定试验 采集具有4～5对复叶的月季小枝条，摘除顶端叶片，保留剩余的新鲜、健康的叶片，用自来水洗净并吸去表面水分。将纱布放入培养皿中，加入7 mL灭菌水，叶片正面朝上放入皿内，每片叶片加入40 μL的孢子悬浮液[11]。用封口膜封严培养皿后，放入25 ℃的培养箱中培养，24 h后，用吸水纸将接种的孢子悬浮液吸去，补加无菌水，接着用封口膜将培养皿封严，放入25 ℃的培养箱中继续培养，中途注意观察，及时补加无菌水。7 d后进行病情统计，记录病斑直径大小。试验设3个重复。

1.2.3 黑斑病抗性的田间接种鉴定试验 选取大棚内健康还未感染虫害病害的鲜嫩叶片，将孢子悬浮液均匀喷洒在供试叶片上，每株喷1 mL孢子悬浮液，用扎有小洞的薄膜迅速覆盖，1 d后，揭除薄膜。3次重复。调查接种后第15天[12]的发病率、病情指数，划分各品种的抗病性。

1.2.4 病情调查 室内鉴定病情的分级标准[11]为1级，0 mm；2级，0～2.0 mm；3级，2.0～3.0 mm；4级，3.0～4.0 mm；5级，4.0～4.5 mm；6级，4.5～5.0 mm；7级，>5 mm。田间接种鉴定病情的分级标准[12]为0级，不发病；1级，发病叶片占总叶片的1/4以下；2级，发病叶片占总叶片的1/4～1/2以下；3级，发病叶片占总叶片的1/2～3/4以下；4级，发病叶片占总叶片的3/4以上(含3/4)。

发病率(%)=感染黑斑病叶片数/调查总叶片数×100

病情指数(%)=∑[(病级株数×病级)/(总株数×最高病级)]×100

1.2.5 抗性划分标准 采用相对抗病性方法评价其抗病程度[11]，抗病程度分为免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)5类，相对抗病指数分别为1.00、0.70～0.99、0.40～0.69、0.20～0.39和0.20以下。

相对抗病性指数= 1-相对病情指数

相对病情指数=鉴定品种病情指数/对照种病情指数(病情指数最高者为对照种)

1.2.6 酶活性测定 采摘展叶4 d左右未染病的正常叶片以及自然感病、病斑明显的病叶。参照徐东生[10]的方法，测定SOD、POD和PPO活性，3次重复。其中SOD以抑制光还原反应50%为1个酶活性单位；POD以每分钟的OD值变化0.01为1个过氧化物酶活性单位；PPO以每分钟OD值变化0.01为1个多酚氧化酶活性单位。

1.2.7 电子扫描显微镜观察 选取鉴定为免疫及高感的野生种各1份，于冬季，裁剪一小段的枝条，枝条上含肉眼看起来生长良好的、未染病的叶片。将采摘带枝条的叶片用蒸馏水洗净后。用洁净刀片切取约4 mm×4 mm长的叶片，用电导胶粘于样品台上，观察面朝上，放入干燥器中干燥5 min左右，在ETD-2000型离子溅射仪中镀金膜3 min，然后置于型号为Quanta-200的扫面电镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 黑斑病抗性鉴定

如表1～2所示，室内鉴定和田间鉴定的结果基本一致，大部分的接种叶片均不同程度感病。室内鉴定46份野生资源中，黑斑病免疫种2份，分别为百叶蔷薇和金樱子；黑斑病高抗种13份，分别为白蔷薇、黄刺玫、细梗蔷薇、亮叶月季、月季花、大花香水月季、白玉堂、伍兹蔷薇、白木香花、小果蔷薇、刺梨、中甸刺玫和硕苞蔷薇；黑斑病中抗种5份，分别为玫瑰、绢毛蔷薇、光叶蔷薇、复伞房蔷薇和川滇蔷薇；黑斑病中感种13份，分别为毛叶蔷薇、中甸蔷薇、大叶蔷薇、多苞蔷薇、钝叶蔷薇、西南蔷薇、野蔷薇、丽江蔷薇、悬钩子蔷薇、卵果蔷薇、长尖叶蔷薇、毛萼蔷薇和狗蔷薇；黑斑病高感种13份，分别为峨眉蔷薇、单瓣黄刺玫、大马士革蔷薇、弯刺蔷薇、多腺小叶蔷薇、刺蔷薇、粉蕾木香、香水月季、粉红香水月季、七姊妹、银粉蔷薇、单瓣白木香和黄木香花。

表1 蔷薇属野生资源抗黑斑病鉴定结果

峨眉蔷薇、多腺小叶蔷薇和刺蔷薇的室内鉴定均为中感，但是其田间鉴定均为高感；毛叶蔷薇、西南蔷薇的室内鉴定均为高感，但是田间鉴定均为中感。高抗野生种主要集中在小叶组和硕苞组；高感主要集中在桂味组。

2.2 酶活性测定

通过对金樱子和粉红香水月季叶片的生理指标的测定，研究发现3种酶活性存在一定的差异。如表3所示，2份野生种感病后3种酶活性均呈现上升状态，其中以粉红香水月季POD活性的升高最明显，达到了254.00 U·min-1·g-1，免疫材料金樱子正常叶片与病叶的SOD、POD和PPO活性均比高感材料粉红香水月季高，更有益于抵御病害。高感材料酶活性上升率高于免疫材料，感病野生种粉红香水月季POD活性上升最明显，达到767.78%，抗病野生种金樱子SOD活性上升幅度最小仅为7.84%。

表2 蔷薇属野生资源抗黑斑病分布

表3 2份蔷薇属野生种酶活性变化

2.3 叶片结构电镜扫描

免疫材料金樱子及高感材料粉红香水月季叶片直观观察没有较大的区别，叶片光滑，叶脉清晰，均未见明显刺毛。电镜扫描结果如图1所示，免疫材料金樱子叶片正面蜡质层密质均匀，角质层细胞明显且排列紧密，细胞间的间隙被填满，其叶片背面的角质层细胞明显且排列紧密，气孔较小且开度小，气孔周围未见明显丝状物；高感材料粉红香水月季叶片正面蜡质层疏散不均匀，角质层细胞排列疏松，其叶背面的角质层细胞模糊，气孔较大且开度也较大，气孔周围有明显的丝状物。

3 讨 论

月季黑斑病是月季重要病害之一，目前防治病害主要依靠化学药剂，例如采用嘧菌酯悬浮剂和氟吡菌胺·霜霉威悬浮剂对低等真菌进行防治[13]，但药剂成本高且容易残留于土壤，对生态环境造成破坏。黑斑病的防治要推行以防为主，药剂为辅，着重于选择高抗月季品种。马燕等[14]利用月季与野生蔷薇杂交，得到了月季抗病新品种—刺玫月季。因此通过挖掘野生蔷薇属抗性种质资源，进行远缘杂交育种，进而获得新的抗病月季品种显得尤为重要。植物抗病受到诸多因素的影响，包括环境因子、外源物、病原菌与植物的互作等，对于黑斑病抗性鉴定方法通常采用田间鉴定和室内鉴定。刘丽等[15]对12份大白菜品种进行抗黑斑病田间鉴定，发现高抗病品种5份。刘邮洲等[16]采用田间鉴定和人工接种鉴定相结合对16份梨品种进行黑斑病抗性鉴定，筛选出4份高抗黑斑病的梨品种‘华酥’、‘早美酥’、‘黄花’和‘丰水’。通过对现有的野生蔷薇属资源9个组的46份野生种的抗黑斑病资源的筛选显示：百叶蔷薇和金樱子为黑斑病免疫材料，占鉴定野生种的4.3%；黄刺玫、腺梗蔷薇等13份野生种是黑斑病高抗的材料，占鉴定野生种的28.3%。

月季感染黑斑病后，各种生理生化水平变化显著。徐东生[10]以2份现代月季抗黑斑病品种和3份感病品种为材料，测定了其SOD、POD及PPO的含量，发现抗病品种的3种酶活性均比感病品种高，高酶活性可以消除病原菌侵染带来的影响，因此低酶活性的感病野生种必须通过大幅度提高酶活性才能抵抗病原物带来的影响。源朝政等[17]认为目前尚未发现完全抗黑斑病的月季品种，但本次实验在月季野生种中发现了免疫材料。目前对于野生种百叶蔷薇和金樱子的抗病研究较少，研究较多的是重视于百叶蔷薇的香气品质和油用价值以及金樱子果实的药用价值。气孔是叶片与外界环境物质交换的重要通道，金樱子叶片革质光滑，相较于高感野生种粉红香水月季的气孔器密度小且气孔开度也较小，蜡质层密质均匀，雨水与昆虫等不易着附其上，减少了病原菌的传播，对植物本身起到了极好的保护作用。李海英等[18]研究表明，大豆高抗灰斑病品种叶表皮气孔密度明显少于感病品种，与本研究结果一致。高抗野生种中黄刺玫和细梗蔷薇等与孙宪芝[19]研究结果一致，弯刺蔷薇却有所差异，这一结果可能与鉴定地点的小气候及该种适应性等因素有关。王芳[20]发现黑暗与弱光、温度25 ℃、碱性土壤更有益于黑斑病原菌的生长。室内鉴定结果与田间鉴定的差异，究其原因是田间抗性鉴定更容易受到外界环境条件和土壤微生物等因素的影响。免疫材料和高抗材料可作为杂交育种手段的优选品种，同时为抗性基因的筛选提供理论依据。

4 结 论

通过对46份蔷薇属野生种质资源的抗黑斑病评价，共发现免疫野生种2份，高抗野生种13份，中抗野生种5份，中感野生种13份，高感野生种13份。不同抗病和感病月季品种在感染黑斑病后，其体内的酶含量会表现明显变化，研究表明，月季叶片受到黑斑病侵染时SOD、POD和PPO活性均有明显的上升趋势。通过电镜扫描免疫及高感材料叶片组织结构显示：叶表面具有均匀蜡质层，角质层细胞排列紧密，气孔密度小等特质的叶片结构更有益于预防黑斑病原菌。通过杂交育种及分子育种等手段将百叶蔷薇和金樱子等免疫和高抗黑斑病抗性基因渗透到现代月季基因组中，加速培育出新型抗病月季品种，不仅防控黑斑病中避免化学药剂的过度使用，同时有助于推进月季绿色产业的发展。