结核分枝杆菌感染对NLRP3炎性小体活化的调控作用研究进展

刘 蕾， 杨 易， 徐金瑞*

(1.宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川 750021)

结核病(tuberculosis，TB)是一种最常见的慢性细菌性疾病。尽管目前已有治疗药物和疫苗，结核病在全世界的死亡率依然非常高。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是TB的致病菌，属于兼性胞内菌。巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞及树突状细胞等均是Mtb的靶细胞。虽然大多数(90%～95%)接触Mtb的个体不会发展成活动性结核，但大多都是Mtb的携带者，Mtb很可能存在于由免疫细胞聚集而成的肉芽肿的紧密组织中，即所谓的潜伏感染[1]。从潜伏感染或者进行性肺病发展为活动性结核病的病例中，因Mtb繁殖不受限制，从而导致病程延长，并伴随着肺实质的破坏。TB仍然是目前影响人类最严重的全球性疾病之一[2]。近年来，对TB发病机制的研究揭示了Mtb感染后引发宿主免疫反应的分子基础。大量研究表明，炎性小体在机体免疫反应中发挥着重要作用，其中对NLRP3炎性小体的研究最为广泛[3-4]。

1 炎性小体

炎性小体是一种多蛋白大分子复合体，炎性小体活化是固有免疫的一部分。炎性小体通过模式识别受体 (pattern recognition receptor，PRR) 识别病原微生物和内源性危险信号，即病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和危险相关分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)， 招募并且激活 Caspase-1，剪切 IL-1β 和 IL-18 分子的前体，产生相应成熟的细胞因子IL-1β和IL-18，参与机体对病原体的清除以及诱导适应性免疫应答的产生。目前发现能够形成炎性小体的 PRR 主要有 NOD 样受体(NOD-like receptor，NLR)、AIM2样受体(AIM2-like receptor，ALR)以及含嘧啶和HIN结构域的蛋白质(Pyrin and HIN domain-containing protein，PYHIN)蛋白家族受体[5]。

NLRP3 是目前研究最多的炎性小体，最初发现它与被称为隐热蛋白相关的周期性综合征的遗传性自身免疫疾病相关，症状是皮疹和发热，NLRP3突变与90多种疾病相关。细胞外ATP、尿酸晶体、细菌成孔毒素、许多病原微生物，如金黄色葡萄球菌、李斯特菌属、肺炎克雷伯菌、奈瑟菌属、白色念珠菌、酿酒酵母菌、仙台病毒、腺病毒、流感病毒等都能够激活 NLRP3 炎性小体[6]。

NLRP1是第一个被描述的炎性小体复合物，在人类中由单个NLRP1基因编码，在鼠中由NLRP1(a～c)编码。NLRP1b炎性小体不像NLRP3炎性小体一样在所有情况下都会导致caspase-1的自身蛋白水解切割，但它仍然能够切割IL-1β并发生焦亡。 在人NLRP1中功能获得突变会导致皮肤病，包括多个自愈性掌跖癌和家族性角化病[7]。研究发现炭疽芽胞杆菌的致死毒素是小鼠NLRP1的配体，人类NLRP1和鼠NLRP1a/c的生理触发因素仍有待发现。

NAIP-NLRC4炎性小体对Ⅲ型分泌系统(T3SS)的细菌成分和革兰阴性细菌的鞭毛蛋白有反应。NAIP蛋白质感知细菌T3SS针头状复合物和鞭毛蛋白质，将多个NLRC4蛋白募集到炎性小体组合物中。最近的研究确定NLRC4炎性小体也受到沙门氏菌感染期间S533上的磷酸化过程的调节，能够在沙门氏菌感染期间形成包含NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD，ASC)分子、caspase-1和caspase-8的炎性小体复合物[8]。

AIM2炎性小体在病毒和细胞内细菌感染期间检测细胞胞质中的dsDNA以及自身DNA。 AIM2的HIN-200结构域以序列非依赖性方式介导dsDNA的结合[9]。

Pyrin蛋白中的功能获得性突变最初被发现与家族性地中海热相关，家族性地中海热是人类的自身炎症性疾病，pyrin蛋白被鉴定为炎性小体复合体的组分。在正常条件下，来自细菌病原体(包括艰难梭菌(TcdB)、副溶血弧菌(VopS))等的Rho-灭活毒素激活pyrin炎性小体[10]。

小鼠NLRP9b炎性小体近期被发现可以在肠上皮细胞中被轮状病毒感染激活。RNA解旋酶Dhx9，可以识别病毒双链RNA，并导致NLRP9b与炎性小体适配子ASC和caspase-1装配，并导致IL-18成熟和gasdermin D介导的焦亡[11]。

2 NLRP3炎性小体

2.1 NLRP3炎性小体的结构

NLRP3炎性小体是目前研究最广泛的炎性小体，在结核病样本中检测到NLRP3炎性小体的激活[3]。NLRP3炎性小体是由NLRP3分子、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD，ASC)分子、pro-caspase-1分子组成的蛋白复合体(图1)。NLRP3包含3个结构域，分别是羧基端富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat，LRR)结构域、中央的核苷酸结合和寡聚结构域(nucleotide-binding and oligomenzation，NACHT)以及氨基端的含吡啶结构的热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)[12]。

在危险信号刺激后，NLRP3分子会发生构象变化并导致自身寡聚化，与接头蛋白ASC通过PYD-PYD相互作用结合，ASC再通过CARD结构域结合pro-caspase-1，从而完成NLRP3炎性小体的组装。炎性小体复合物在将Caspase-1前体转化为活化的Caspase-1 p20和 p10中起着关键作用，并促进下游IL-1β和IL-18的活化和分泌[13]。

图1 NLRP3炎性小体的结构Fig.1 Simplified structure of NLRP3 inflammsome

2.2 NLRP3炎性小体活化机制

NLRP3炎性小体的激活过程分为起始和组装两部分。①起始阶段：该阶段TLR-NF-κB信号通路参与促进NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的转录和表达[14]。c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1)磷酸化NLRP3，为下游炎性小体的激活做准备[15]。②激活阶段：发生外界刺激，NLRP3分子自身发生寡聚化，并通过ASC招募pro-caspase-1，从而完成炎性小体的组装。NLRP3炎性小体激活后会使线粒体内的组分释放到胞质中，释放组织蛋白酶，并激活下游炎性信号。

目前，对NLRP3炎性小体激活机制主要包括钾离子外流、溶酶体破裂、线粒体活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)、内质网应激。①钾离子外流引起NLRP3炎性小体活化[16](图2)。P2X嘌呤受体7(P2X7)与ATP结合后被激活，离子通透性改变，细胞膜上的离子通道开放，胞内钾离子外流，使胞内的低钾环境激活NLRP3炎性小体[17-18]。最近有研究发现，NIMA相关蛋白激酶7(NIMA-related kinase 7，NEK7)是NLRP3上游的重要分子[19]。NEK7与NLRP3分子的结合对于NLRP3炎性小体至关重要，研究还发现NEK7可以调节钾离子流[20]，NEK7调节下游的IL-1β活化是通过与NLRP3分子的相互作用还是通过调节钾离子流仍然需要进一步研究。②溶酶体膜的破裂引起NLRP3炎性小体活化。溶酶体膜破裂使溶酶体的组分组织蛋白酶B释放到胞质中激活NLRP3炎性小体[21]。③线粒体ROS引起NLRP3炎性小体活化。研究发现，ROS不仅可以直接参与NLRP3炎性小体活化，而且过量ROS还会使细胞内产生硫氧还蛋白，胞内游离的硫氧还蛋白与NLRP3分子结合，促进NLRP3炎性小体的激活。④内质网应激引起的NLRP3炎性小体活化。研究发现内质网应激可以通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白信号通路促进pro-IL-1β的转录和表达。内质网应激也会引起胞内钙离子浓度升高、线粒体损伤以及下游的ROS升高使NLRP3炎性小体激活[22]。

另外，在NLRP3分子缺陷型和ASC分子缺陷型细胞中仍然发现有IL-1β细胞因子的释放[23-24]，caspase1和caspase11双缺陷型小鼠获得的树突状细胞仍然可以分泌IL-1β和IL-18，虽然比野生型细胞低[25]，说明存在NLRP3炎性小体非依赖的方式分泌这些细胞因子。

3 Mtb感染对NLRP3炎性小体活化的作用

3.1 Mtb感染对NLRP3炎性小体活化的激活作用

作为结核病的标志，Mtb在活动性结核期间会诱发全身性炎症反应。炎症的分子调节与炎性小体的组装有关。Mtb可以特异性活化NLRP3炎性小体，Mtb触发炎性小体激活的程度影响小鼠模型中TB的严重程度[26]。

图2 NLRP3炎性小体的活化Fig.2 NLRP3 inflammasome activation

ESX-1系统被认为是Mtb致病性的一个关键介质，缺乏ESX-1的突变株在巨噬细胞内复制有缺陷，并且实验小鼠的结核病症状显著减轻。Mtb的毒力相关差异区域1(region of difference 1，RD1)基因编码ESX-1系统的许多毒力因子，毒力因子释放到受感染细胞使吞噬体膜破裂，而吞噬体膜破裂是Mtb胞质逃逸的重要先决条件[27]。Mtb刺激巨噬细胞释放成熟的IL-1β，而减毒的牛分枝杆菌BCG缺失RD1区，不能刺激巨噬细胞释放成熟的IL-1β，说明ESX-1系统是NLRP3炎性小体活化的关键因素[17，28]。

ESX-1系统的各个组成部分如何协同工作以激活NLRP3炎性小体及产生一个完整的分泌机制还不完全清楚，其效应蛋白的精确功能和性质也不清楚。大多数关于ESX-1系统与免疫元件相互作用的研究都集中在6 kD早期分泌抗原靶(6 kD early secreted antigen target 6, ESAT6)和10 kD培养滤液蛋白(culture filter protein 10, CFP10)上，这两种底物是Mtb免疫过程中结合T细胞的主要抗原[29]。这些蛋白质以异二聚体的形式分泌，需在共分泌蛋白质的辅助下通过分泌装置[30]。ESAT-6具有膜通透性，通过其膜溶解能力激活NLRP3炎性小体[17，28]，ESAT-6缺失的细菌突变体感染能力明显减弱[31]。除ESAT-6和CFP-10外，一些ESX-1分泌相关蛋白(ESX-1 secretion-associated proteins,Esp)被认为是候选底物，与ESAT-6一起诱导宿主细胞裂解，有利于Mtb的维持。由于ESX-1在细菌效应物向宿主细胞溶胶转移中的重要性，其表达对细胞内包括炎性小体在内的模式识别受体激活有强烈影响。

尽管ESAT-6是Mtb非常重要的毒力因子，但最近的研究表明，单独ESX-1底物与宿主免疫反应之间的相互作用比最初预期的更为复杂。例如，ESAT-6分泌减弱的各种减毒菌株(如H37Ra、DEspC、DEspA)仍然能够刺激小鼠和人巨噬细胞产生IL-1β[32]。这表明其他ESX-1底物也可以在吞噬体膜上穿孔及诱发后续的炎性反应，这些底物在Mtb侵染细胞中发挥的作用仍需要进一步的研究。

除ESX-1，研究人员发现ESX-5在Mtb感染巨噬细胞后也可引起分泌IL-1β[33]。Mtb的 ESX-5突变株在体内的生长减慢，表明ESX-5可能也与Mtb的毒力有关[34]。ESX-5激活炎性小体的机制仍然需要进一步研究。

除了分泌系统分泌的相关蛋白外，研究还发现Mtb的双链RNA可以使Caspase-1激活。将Mtb未处理的总RNA和RNase I(降解单链RNA)处理过的总RNA，RNase III(降解双链RNA)处理过的RNA分别转染到细胞中，发现未处理的总RNA和RNase I处理过的总RNA都可以使Caspase-1活化，但是未处理的总RNA和RNase I处理过的总RNA不能使Caspase-1活化，说明Mtb双链RNA可以特异地使NLRP3炎性小体激活[35]。

3.2 Mtb感染对NLRP3炎性小体活化的抑制作用

在Mtb感染后，炎性小体的活化有助于细胞清除Mtb，限制Mtb的生存和迁移。但是在大多数情况下，感染不会导致疾病，因为芽胞杆菌已经进化出逃避炎性小体活化的策略，与免疫反应保持平衡，从而保持潜伏数十年[36]。机体对抗Mtb免疫反应的一个标志是肉芽肿的形成，肉芽肿内一些被感染的细胞发生坏死，形成一个无细胞的中央区，Mtb在此处继续留在肉芽肿内。研究发现，Mtb强毒株可能通过锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zn-metalloprotease，Zmp1)和酪氨酸磷酸酶A(tyrosine phosphatase，Ptp A)调节宿主代谢，直接或间接抑制NLRP3炎性小体，但其具体机制仍有待进一步研究。

研究发现，Zmp1可以抑制吞噬体溶酶体的融合[37]和限制IL-1β的产生和激活，有助于Mtb的逃逸和增殖。通过用Zmp1缺失或减弱的Mtb感染巨噬细胞，触发了NLRP3炎性小体的激活，导致IL-1β分泌增加，含Mtb的吞噬体成熟增强，巨噬细胞对Mtb的清除增加，以及被气溶胶感染的小鼠肺部载菌量降低[38]。通过使用不能抑制IL-1β产生的Zmp1 Mtb突变体，证实了在TB动物模型中，吞噬体成熟的阻滞、Mtb细胞内存活和完全毒力都依赖于Mtb对炎性小体激活的主动抑制作用[38]。

Ptp A抑制宿主先天免疫信号通路。在细胞质中，Ptp A抑制JNK/p38 MAPK和NF-κB信号通路[39]，JNK/p38 MAPK和NF-κB信号通路进而影响NLRP3 炎性小体组分的转录[40]。在吞噬体的成熟过程中，Ptp A可促进吞噬体的组成通过质膜分子再利用和依次获得早期内体、晚期内体和溶酶体相关分子发生改变，进而抑制吞噬体与溶酶体的融合及吞噬体的酸化[41]，发挥对NLRP3炎性小体活化的抑制作用[42]。在细胞核中，Ptp A具有调节宿主细胞的免疫、迁移、增殖等基因表达的作用[43]。Ptp A对NLRP3炎性小体活化的调控机制仍需要进一步的研究。

4 展 望

本文综述了NLRP3炎性小体活化的机制及Mtb感染对NLRP3炎性小体活化的调控作用。通过在Mtb感染的不同时期，对NLRP3炎性小体进行与Mtb感染相反的调控，可能对控制Mtb在体内的侵染、增殖、迁移等起到有效的控制作用，从而有效控制结核病的发展。尽管在Mtb感染后NLRP3 炎性小体的活化研究目前已经取得了很大进展，但尚有很多问题亟需解决，包括NLRP3炎性小体在Mtb感染后参与调控的具体途径，NLRP3炎性小体在Mtb感染后与其他信号通路之间的相互调控与联系，以及NLRP3炎性小体在Mtb感染中具体的作用机制等。对Mtb感染期间NLRP3炎性小体活化的更全面了解将为结核的有效宿主导向治疗或辅助治疗提供新的潜在靶点。