岩藻黄素抗D-gal诱导SH-SY5Y细胞衰老作用及机制研究*

朱敏敏，李云鹏，张 淼，李晓双，成 敏，周珍琼，刘顺梅，4**

(1.潍坊医学院生命科学与技术学院，山东潍坊 261053；2.潍坊医学院科研处，山东潍坊 261053；3.潍坊医学院基础医学院，山东潍坊 261053；4.潍坊医学院医学研究实验中心，山东潍坊 261053)

0 引言

自噬(Autophagy)是一种自降解过程，通过清除体内衰老和受损的细胞器以实现细胞的自我更新。适度的自噬通过消化、降解胞内受损的DNA、功能失调的线粒体等降低氧化应激，可延缓细胞的衰老[1,2]，但自噬过度也会加速细胞的衰老。在衰老进程中，细胞自噬作用呈下调趋势。然而，自噬可被机体内外的多种因素诱导而发生，自噬能调整细胞在应激条件下的存活能力，不同因素诱导的自噬作用增强是多种真核生物寿命延长所必需的[3,4]。研究表明自噬与细胞衰老具有非常密切的关系，是极其重要的衰老相关的调节机制[5,6]。自噬与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的发生密切相关，自噬相关通路的缺陷可能会导致上述疾病的发生[7,8]。由此看来，能调控神经细胞自噬的物质可能会对神经退行性疾病的预防具有重要意义，对这类物质的研究有可能为神经退行性疾病的防治提供新思路和新药物。

岩藻黄素(Fucoxanthin，FUCO)是广泛存在于褐藻和硅藻中的类胡萝卜素，具有抗癌[9,10]、抗氧化[11,12]、降血糖[13,14]等多种生物活性。Lashmanova等[15]和 Moskalev等[16]用果蝇和线虫研究发现FUCO具有延缓衰老的作用，本课题组也发现FUCO可抑制H2O2引起的人WI-38细胞早衰[17]，Zhang等[18]发现FUCO能通过调控自噬途径减轻外伤对神经细胞的损伤作用。

鉴于神经自噬与个体衰老、神经退行性疾病的发生都具有非常密切的关系，本研究利用D-gal诱导建立神经细胞衰老模型，研究FUCO抗神经细胞衰老的作用，并探讨自噬是否参与其抗衰老作用过程，以期为FUCO的药用活性研究提供理论基础，为我国丰富的海藻资源的高值化利用及衰老相关神经退行性疾病的预防治疗提供理论指导与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

CO2细胞培养箱(Thermo Scientific，150i)；酶标仪(Thermo Scientific，Multiskan Go)；透射电子显微镜(日立，HT-7700)；化学发光凝胶成像系统(ProteinSimple，FluorChem Q)。

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞，上海酶研生物科技有限公司)；FUCO(Sigma，纯度为≥95%)；D-半乳糖(D-Galactal，D-gal，索莱宝生物科技有限公司，纯度为99.0%)；噻唑蓝(MTT)、丙二醛(MDA)及SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；雷帕霉素(Med Chem Express)；β-actin小鼠单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(中杉金桥生物技术有限公司)；mTOR、LC3及ATG5兔单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology)。

FUCO的配制：将50 mg FUCO用10 mL二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)溶解，涡旋振荡促进FUCO充分溶解，FUCO终浓度为7 588 μmol/L，分装后置于冰箱-80℃保存备用。

D-gal的配制：称取适宜质量的D-gal，用DMEM高糖培养基溶解，配成浓度为300 mg/mL的母液，在超净工作台用0.22 μm一次性无菌过滤器过滤，分装后置于冰箱-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 D-gal对SH-SY5Y细胞活力的影响

实验分组：设空白对照组(仅用DMEM培养基培养)和不同浓度D-gal组(DMEM培养基中分别含5，10，20，30，40，50 mg/mL D-gal)，每组6个复孔，实验重复3次。

细胞以5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24 h后，空白对照组吸弃孔内原有培养基，加入新的DMEM培养基，其余各组吸弃孔内原有培养基，加入含不同浓度D-gal的DMEM培养基，置于细胞培养箱中继续培养12 h。12 h后按照MTT试剂盒说明书检测各组的细胞活力。

1.2.2 D-gal对SH-SY5Y细胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影响

根据MTT实验结果，5 mg/mL的D-gal处理组细胞活力与空白对照组相差很小，故本实验中D-gal最低浓度选择10 mg/mL。实验设空白对照组(仅用DMEM培养基培养)和不同浓度D-gal组(培养基中含10，20，30，40，50 mg/mL D-gal)，每组3个复孔。

将细胞接种于12孔板中，药物处理方法同1.2.1节。依据SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书的方法步骤检测各组细胞SA-β-半乳糖苷酶的活性。在光学显微镜下观察各组细胞蓝染情况，每个复孔随机选取3个视野(每组共选取9个视野)计数细胞总数及蓝染阳性细胞数，计算各组SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞率(蓝染阳性细胞数/细胞总数×100%)。

1.2.3 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞活力的影响

实验分组：实验设空白对照组(Con)、D-gal模型组(Mod，30 mg/mL D-gal)、维生素E对照组(VE，30 mg/mL D-gal +50 μmol/L VE)和3个FUCO组。FUCO组分别用F5 (30 mg/mL D-gal + 5 μmol/L FUCO)、F10 (30 mg/mL D-gal +10 μmol/L FUCO)和F20 (30 mg/mL D-gal+20 μmol/L FUCO)表示，每组设6个复孔，实验重复3次。

细胞悬液以5×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，24 h后，空白对照组和模型组吸弃孔内原有培养基，更换新的DMEM培养基，其余各组吸弃孔内原有培养基，换为含不同浓度药物的培养基。各组置于培养箱中预培养2 h后，除空白对照组外，其余各组均加入D-gal溶液，使其终浓度为30 mg/mL，在培养箱中培养12 h后，用MTT法检测各组细胞活力。

1.2.4 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影响

实验分组和药物处理同1.2.3节。将细胞接种于12孔板中，每组3个复孔。细胞培养结束后按照SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书的检测方法，检测各组细胞的SA-β-半乳糖苷酶活性。显微镜下每个复孔随机选取3个视野计数SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞率(同1.2.2节)。

1.2.5 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞脂质过氧化物(MDA)含量的影响

将细胞接种于含有DMEM培养基的无菌培养皿中培养，实验分组和药物处理同1.2.3节，药物处理结束后，将各组细胞吸弃原有培养基，PBS清洗两次，每皿各加入150 μL裂解液(磷酸酶抑制剂∶蛋白酶抑制剂∶RIPA裂解液=1∶1∶100，体积比)，冰上裂解20 min。裂解结束后用细胞刮刮下细胞，收集裂解液于1.5 mL离心管中，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，按照MDA检测试剂盒说明书检测各组细胞的MDA含量。MDA含量=样品MDA含量/单位重量的蛋白含量。

1.2.6 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬体的影响

实验分组同1.2.3节，另设自噬阳性对照雷帕霉素组(Rapamycin，RAP，DMEM培养基中含有20 μmol/L的RAP)和自噬阴性对照3-甲基腺嘌呤组(3-methyladenine，3-MA，DMEM培养基中含有5 μmol/L的3-MA)。细胞以1×107个/皿接种于无菌平皿中，24 h后，空白对照组和模型组吸弃孔内原有培养基，更换新的DMEM培养基，其余各组吸弃孔内原有培养基，换为含不同浓度药物的培养基。培养2 h后，空白对照组吸弃原有培养基，更换新的DMEM培养基，其余各组均加入D-gal溶液至其终浓度为30 mg/mL，继续在培养箱中培养12 h。12 h后收集各组细胞用3%戊二醛固定过夜，梯度酒精脱水后用环氧树脂包被，超薄切片后固定于铜网中，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别固定15-30 min，在透射电子显微镜下观察自噬体的形成情况。

1.2.7 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬相关基因蛋白表达的影响

实验分组和药物处理同1.2.6节。经D-gal处理12 h后，各组细胞在冰上进行裂解，收集细胞裂解液于离心管中，4℃、12 000 r/min离心，取上清用聚氰基丙烯酸正丁酯法(BCA法)检测蛋白浓度。每组各取20 μg总蛋白至加样孔中进行SDS-PAGE电泳，经转膜、封闭、洗涤后，目的蛋白分别与β-actin小鼠单克隆抗体溶液、mTOR、LC3及ATG5兔单克隆抗体溶液在4℃孵育过夜;次日，洗掉一抗后，上述目的蛋白再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗溶液在室温孵育2 h，然后用化学发光凝胶成像系统进行显影，用ImageJ软件进行灰度分析。

1.2.8 统计学方法

2 结果与分析

2.1 SH-SY5Y细胞衰老模型的建立

2.1.1 D-gal对SH-SY5Y细胞活力的影响

不同浓度D-gal处理SH-SY5Y细胞12 h后各组细胞活力见图1。设空白对照组细胞活力为100%，与对照组相比，5，10，20，30，40，50 mg/mL D-gal组细胞活力分别降至(94.24±9.03)%、(93.68±7.83)%、(88.10±11.07)%、(80.78±6.91)%、( 49.66±7.87)%、(37.92±4.41)%，细胞活力随D-gal的浓度增加明显下降。显微镜下观察可见空白对照组细胞生长良好，细胞边缘清晰，而高浓度D-gal处理的细胞边缘模糊，细胞变圆且数量减少。实验结果表明D-gal浓度超过30 mg/mL时会对细胞产生较大毒性作用。

*:P<0.05 D-gal组 vs 空白对照组

2.1.2 D-gal对SH-SY5Y细胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影响

如图2所示，与空白对照组相比，经D-gal处理的SH-SY5Y细胞均有不同程度的蓝染，10，20 mg/mL D-gal组细胞蓝染程度较浅，30，40，50 mg/mL D-gal组细胞蓝染程度加深，且部分细胞变圆，体积增大，细胞数量减少。不同浓度D-gal组的SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞率均较空白对照组明显增高(P<0.05)。上述结果表明D-gal可诱导SH-SY5Y细胞早衰，可用于建立细胞衰老模型。

*:P<0.05 D-gal组 vs 空白对照组

2.2 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞活力的影响

如图3所示，设空白对照组细胞活力为100%，与空白组相比，模型组细胞活力下降明显，为(73.56±5.98)%，且两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，VE组的细胞活力增加(P<0.05)。5,10 μmol/L FUCO处理组的细胞活力分别为(90.11±7.17)%、(84.71±6.33)%，均比模型组细胞活力明显增高(P<0.05)，20 μmol/L FUCO组细胞活力与模型组相比无明显差异(P>0.05)。实验结果说明FUCO可抑制D-gal引起的细胞活力下降，具有较好的抗细胞衰老作用。

#:P<0.05 Mod vs Con，*:P<0.05 药物组 vs Con

2.3 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞SA-β-半乳糖苷酶活性的影响

如图4所示，与空白对照组相比，模型组的细胞蓝染程度加深，蓝染细胞阳性率增高。与模型组相比，VE组的蓝染细胞阳性率降低(P<0.05)，且蓝染程度变浅；5,10 μmol/L FUCO组蓝染细胞阳性率较模型组明显减少(P<0.05)，且蓝染程度下降；与模型组相比，20 μmol/L FUCO组蓝染细胞阳性率减少，但与模型组之间无明显差异(P>0.05)。SA-β-半乳糖苷酶活性增加是细胞衰老的重要标志物，也是检测衰老的金标准。本实验结果充分说明FUCO可以逆转D-gal引发的细胞衰老，具有较强的抗衰老活性。

#:P<0.05 Mod vs Con，*:P<0.05 药物组 vs Con

2.4 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞MDA含量的影响

从图5可以看出，模型组细胞的MDA含量明显高于空白对照组，为空白组MDA含量的5倍多。VE组及5,10 μmol/L FUCO组的MDA含量明显低于模型组(P<0.05)，20 μmol/L FUCO组的MDA含量低于模型组，但二者之间无明显差别(P>0.05)。

#:P<0.05 Mod vs Con，*:P<0.05 药物组 vs Con

2.5 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬体的影响

如图6所示，空白对照组细胞结构正常，线粒体数目较多，细胞偶尔出现自噬体(箭头)。Mod组部分细胞出现体积变大、核仁变小甚至消失、线粒体肿胀等不良状态，状态好的细胞内自噬体数量较少，但状态不好的细胞内可见大量自噬体。与模型组比，VE组的细胞边界清晰，核仁清楚，自噬体数目有增多趋势；F5组细胞状态好，线粒体数目较多，胞质内自噬体数量也较模型组中状态良好的细胞内自噬体数量有所增多；F10和F20组自噬体明显增多，且随FUCO浓度增大而增多，高倍镜下可清楚地观察到自噬体中包含着多种细胞内容物。自噬阳性对照RAP组的自噬体数目最多，自噬阴性对照3-MA组细胞内自噬体数目比RAP组明显减少。透射电子显微镜下观察自噬体形成情况可以直观反映细胞内自噬作用大小，本实验结果说明FUCO可以增强细胞内的自噬活性。

图6 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬体的影响

2.6 岩藻黄素对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬相关蛋白的影响

图7所示为自噬相关蛋白检测结果。与空白组相比，模型组ATG5蛋白表达和p-mTOR/mTOR蛋白表达比值均上调(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值下调(P<0.05)。与模型组相比，VE组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值轻度上调，p-mTOR/mTOR比值下调(P<0.05)。F5组ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p-mTOR/mTOR比值均较模型组有所下调，F10、F20及自噬阳性对照RAP组细胞的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显较模型组上调(P<0.05)，p-mTOR/mTOR比值明显下调(P<0.05)。自噬阴性对照3-MA组ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较RAP组下调，p-mTOR/mTOR比值较RAP组上调。

#：P<0.05 Mod vs Con，*：P<0.05 药物组 vs Con

3 讨论

3.1 D-gal诱导SH-SY5Y细胞建立细胞衰老模型

D-gal是建立衰老模型的常用诱导剂[19]。Li等[20]的研究表明浓度高于30 mg/mL的D-gal可明显引起SH-SY5Y细胞活力下降，Shen等[21]用55 mmol/L D-gal诱导星形胶质细胞一周成功建立细胞衰老模型。本实验发现，D-gal浓度过大，会导致细胞大量死亡，结合细胞活力和SA-β-半乳糖苷酶活性实验结果，最终选用30 mg/mL的D-gal处理细胞12 h成功建立SH-SY5Y细胞衰老模型，该结果与Li等[20]实验结果相似。

3.2 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞的抗衰老作用

细胞衰老时会出现细胞活力下降、SA-β-半乳糖苷酶活性增加、MDA含量升高等状况。本研究通过检测上述3个指标探讨FUCO对D-gal诱导细胞衰老的干预作用。研究发现，5，10 μmol/L的FUCO能明显抑制D-gal引起的细胞活力下降(P<0.05)，20 μmol/L的FUCO作用不明显(P>0.05)，且随着FUCO浓度的增大，细胞活力表现出一定下降趋势。FUCO对D-gal引发的衰老标志物SA-β-半乳糖苷酶的活性增高也具有较好的抑制效应，表现为5，10 μmol/L FUCO组比D-gal模型组的SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数明显减少(P<0.05)，细胞蓝染程度较浅；20 μmol/L FUCO组SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞率比模型组降低，但两组之间无明显差异(P>0.05)。上述结果与本课题组前期研究[17]中发现5，10 μmol/L的FUCO可抑制H2O2诱导的WI-38细胞的活力下降和SA-β-半乳糖苷酶活性增高结果相似。

MDA是脂质过氧化反应产物，MDA的含量升高是细胞衰老的重要标志之一。本实验发现模型组比空白组细胞的MDA含量明显增高，而5-20 μmol/L的FUCO可明显降低D-gal诱导的MDA含量增高。Zeng等[22]发现3 μmol/L FUCO就可明显降低TBT诱导的HepG2细胞内的MDA含量。上述结果表明FUCO可抑制外界刺激引发的细胞脂质过氧化，延缓细胞衰老的发生。

以上关于细胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性和MDA含量检测实验中，我们发现5，10 μmol/L FUCO的抗衰老作用效果相差很小，20 μmol/L FUCO的抗衰老效果与前二者比相差较大，3个FUCO组没有表现出特别明显的剂量-效应关系。Zhang等[18]在研究FUCO对外伤引起的小鼠继发性脑损伤的干预作用时发现，灌胃给药的50，100,200 mg/kg 3个剂量中100 mg/kg的抗损伤作用效果最好，脑室注射给药的 0.01，0.05,0.1 mmol/L 3个剂量中0.05 mmol/L的抗损伤效果最好，该研究中两种给药方式都没有发现明显的药物量效关系。综合考虑本研究及Zhang等[18]的研究结果，没有出现明显的量效关系的原因可能是设置的3个FUCO 浓度不太合适，应设置更多的浓度梯度，例如可在低于5 μmol/L及10-20 μmol/L增设适当的药物浓度，这样有可能会检测到较明显的量效关系，下一步将验证该设想。

Lashmanova等[15]研究表明0.3-5.0 μmol/L FUCO能延长黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫的寿命。无毛老鼠局部使用0.001%的FUCO溶液预处理可减轻UVB诱导的光老化过程中皱纹的形成[23]。结合本实验结果，FUCO对D-gal诱导的神经细胞衰老具有较好的抑制作用。

3.3 FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬的影响

自噬是细胞的一种生存策略，细胞自噬对于维持细胞和个体的健康具有重要作用。适度激活细胞自噬具有抗衰老作用，调节细胞自噬水平已成为抗衰老的重要策略。有研究表明FUCO可通过Nrf2自噬途径在颅脑外伤模型中提供神经保护作用[18]，表明FUCO可能会通过调控自噬途径来对抗D-gal引起的神经细胞衰老。但目前还未发现有FUCO介导自噬途径抗衰老的研究报道。因此，本研究探讨了FUCO对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞自噬的影响作用。

透射电子显微镜观察自噬体形成的研究结果显示，空白对照组细胞发生自噬的水平较低，而D-gal模型组细胞自噬体数量明显比空白组高，这与前人使用D-gal诱导细胞或动物衰老研究的结果相似[24,25]，说明D-gal可引起细胞发生自噬。与模型组相比，F10、F20和RAP组细胞内自噬体数量明显比模型组增多，Western blot检测自噬相关蛋白表达的结果也显示上述3个组中细胞内的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值较模型组上调，p-mTOR/mTOR蛋白比值较模型组下调，表明上述3组细胞的自噬作用比模型组增强。从Western blot检测结果可以看出，随着FUCO浓度增大，F5、F10和F20组的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值表现出明显浓度依赖性，p-mTOR/mTOR蛋白表达比值未表现出明显的剂量-效应关系，仅有F10和F20两组的p-mTOR/mTOR比值随浓度增加表达下调，该结果也与这两组的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值表现出的自噬增强趋势相吻合。F5组细胞的ATG5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较模型组下调，意味着自噬作用减弱，这与透射电子显微镜结果显示F5组细胞较模型组自噬作用增强不一致，但本实验结果还发现F5组的p-mTOR/mTOR比值较模型组显著下调(P<0.05)，这与其自噬体数目较模型组增多是吻合的。针对F5组自噬相关蛋白的表达与透射电子显微镜观察结果不一致的问题，将通过实验进一步验证。

从自噬体及自噬相关蛋白检测结果来看，FUCO在5-20 μmol/L浓度范围内可增强细胞自噬，其中20 μmol/L FUCO组自噬作用最强。综合分析本研究细胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性和MDA含量检测结果，发现20 μmol/L FUCO对细胞的保护作用并不明显，5,10 μmol/L FUCO的抗细胞衰老作用明显优于20 μmol/L。考虑到20 μmol/L FUCO组的自噬作用最强，猜想F20组很有可能是由于过度激活自噬，对细胞造成了一定的伤害。这一猜想与胡晶晶等[26]在研究大鼠心肌缺血再灌注损伤中提到的过度自噬是损伤的原因，抑制自噬过度激活可减轻损伤的观点类似。综上所述，我们认为FUCO可通过适度激活自噬途径抑制D-gal诱导的SH-SY5Y细胞衰老。

值得注意的是，尽管透射电子显微镜观察结果显示模型组的自噬体数目比空白对照组多，但模型组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值较空白组下调，p-mTOR/mTOR蛋白比值较空白组上调，这二个比值与细胞自噬增强时该蛋白的变化趋势不吻合。但是，考虑到自噬与衰老过程都是由多条信号通路共同介导完成，其中mTOR、SIRT1以及p53等是多条信号通路的交叉点[27]，是调控二者的关键蛋白，受众多因素的调控，特别是mTOR分子，他是自噬调控信号通路中一个关键位置的激酶，多种信号分子可调节其活性，mTOR上游的MAPK/Erk1/2、PI3K-1/Akt等信号都会影响mTOR的活性，Yu等[28]也发现FUCO可通过激活PI3K-1/Akt并抑制Erk途径保护H2O2引起的神经细胞损伤。p53蛋白也可影响mTOR的活性，p53在特定位置的适度过表达可抑制mTOR，激活自噬，而其过度表达反而会抑制自噬，使细胞表现出衰老的症状[27]。因此，对于模型组的p-mTOR/mTOR和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达与透射电子显微镜结果不一致的问题，还需通过排除自噬调控复杂通路中其他蛋白对自噬的影响才能阐明原因。

4 结论

本研究中细胞活力、SA-β-半乳糖苷酶活性和MDA含量检测结果表明，FUCO在5-10 μmol/L时对D-gal诱导衰老的神经细胞具有明显的抑制作用，20 μmol/L FUCO的抗衰老作用较差。对细胞自噬体形成及自噬相关蛋白的研究结果表明，FUCO很可能是通过适度激活细胞自噬来发挥其抗衰老作用。