Circ_0007142吸附miR-647调控CCR8基因 促进胃癌细胞的上皮-间质转化和侵袭

张学成，关晓辉

1.吉林市中心医院消化科，吉林 吉林 132000；2.北华大学附属医院消化内科，吉林 吉林 132000

胃癌发病率和死亡率高，是具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤之一［1］。手术治疗、化疗、靶向治疗是目前治疗胃癌的有效方法［2］。胃癌具有高转移和侵袭的特征，因此晚期患者的治疗效果不佳［3］。所以，加深对胃癌的认识，在分子水平上探讨发病机制，寻找新的治疗靶点显得尤为重要。

环状RNA（circRNA）因其不易被核酸外切酶降解的特性而备受关注，能在体内保持稳定，具有作为疾病诊断标志物的巨大潜力［4］。近年来，研究［5］发现circRNA可以作为癌症的启动因子，例如circ-UMAD1在甲状腺癌患者的血清中表达相对较高，具有较高的生物标志物潜能。Circ_0003829在口腔鳞癌中表达降低，受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析circ_0003829在口腔鳞癌中具有较高的敏感性，可以作为口腔鳞癌诊断的生物标志 物［6］。同样，circRNA也可以作为胃癌的启动因子，例如circ_0005556、circ-RNF111都可以促进胃癌的发展［7-8］。Circ_0007142作为最新发现的circRNA，被鉴定为结直肠癌的致癌基因，能促进结直肠癌的进展［9］，但在胃癌中的作用目前还没有被揭示。

经研究［10］发现，circRNA可以作为竞争性内源RNA，海绵化microRNA，进而调节下游靶基因，参与疾病的发展。在食管癌中circ_0008717通过调控miR-203/Slug来促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移［11］。microRNA是一类短链RNA，属于非编码RNA的一个亚类，经常被视为抑癌基因并结合上游circRNA来进行研究，Xu等［12］在关于结直肠癌的研究中发现circRNA DSCAM-AS1通过miR-137/Notch1促进癌症发展，miR-137可以逆转DSCAM-AS1对结直肠癌的促进作用。Ma等［13］认为血清中miR-647的降低与胃癌患者的不良预后相关。但circ_0007142结合miR-647在胃癌中的作用尚未被证实，另外有研究［14］发现，miR-647的下游存在靶基因CC族趋化因子受体8（CC chemokine receptor 8，CCR8），抗CCR8治疗可以有效地抑制小鼠结肠癌肿瘤的生长。此外也有研究［15］表明胃淋巴瘤中CCR8表达上调。

根据以上发现，本研究探讨circ_0007142吸附miR-647调控CCR8在胃癌发展过程中的生物学作用，旨在为胃癌的靶向治疗提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 细胞系与材料

GES-1细胞、AGS细胞、SNU-16细胞、GES-1细胞专用培养基、AGS细胞专用培养基均购自宁波明舟生物科技有限公司。TRlzol分离试剂、高容量cDNA反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒、7500 Fast RTFQ-PCR系统、LipofectamineTM3000试剂、PVDF膜均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。荧光原位杂交（fluorescencein situhybridization，FISH）实验试剂盒购自上海歌凡生物科技有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。pmirGLO双萤光素酶报告基因载体质粒、HEK-293T细胞均购自BioVector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。RIP试剂盒购自广州吉赛生物科技股份有限公司。Matrigel基质胶购自上海前尘生物科技有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司。荧光显微镜购自徕卡显微系统（上海）有限公司。0.1%结晶紫染色、0.5%结晶紫染色、RIPA裂解液均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 临床组织与实验动物

从北华大学附属医院获取2018年3月—2020年4月就诊的胃癌患者的癌组织与邻近癌旁正常组织48组（距离原发灶边缘4.0～6.5 cm），其中男性患者25例，女性患者23例，TNM分期为：Ⅰ～Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者20例。参与该研究的所有患者承诺之前从未接受过任何放疗及化疗，并签署知情同意书。本实验严格遵守北华大学附属医院伦理委员会的要求。获取的组织存放于液氮中进行保存。20只SPF级BALB/c无菌裸小鼠，5周龄，质量为（19±2）g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。

1.3 细胞培养和转染

本研究使用人正常胃黏膜细胞GES-1和人胃癌细胞系AGS、SNU-16进行实验，GES-1细胞使用RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%青霉素链霉素混合液进行培养，AGS、SNU-16细胞使用F-12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素及链霉素混合液进行培养。所有细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%的环境中培养，1 d后更换新鲜培养基，继续进行培养。

当细胞培养到70%左右融合度，按照实验分组进行转染，siRNA质粒载体、miRNA抑制剂、miRNA过表达载体均来自上海吉玛基因有限公司，体外实验分组为si-NC、si-cicr_0007142、miR-647 NC、miR-647 mimic、si-cicr_0007142+inhibitor NC、si-cicr_0007142+miR-647 inhibitor、miR-647 mimic+vector、miR-647 mimic+OE-CCR8；体内实验分组为si-NC、si-cicr_0007142。制备细胞悬液，植入96孔板中，使用LiopfectamineTM3000转染试剂进行转染，步骤按照试剂盒出厂说明书进行。

1.4 RTFQ-PCR

根据试剂盒要求使用TRIzol试剂提取样本中的总RNA，并对RNA的浓度、纯度进行检测。根据高容量cDNA反转录试剂盒的要求将总RNA合成第一链cDNA。引物由苏州金唯智生物科技有限公司提供（表1）。最后根据RTFQ-PCR试剂盒要求，在7500 Fast实时荧光定量PCR系统上进行检测。相对表达量使用2-ΔΔCt计算，U6将miRNA进行标准化，GAPDH将circRNA和CCR8标准化。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab.1 RTFQ-PCR primer sequences

1.5 FISH实验

样本在4%多聚甲醛室温下固定30 min，DEPC水洗并干燥，30%H2O2+纯甲醇对样本进行处理，再滴加0.25%的HCl溶液，15 min后用DEPC水洗。样本加入蛋白酶K反应20 min，用0.1 mol/L甘氨酸洗液终止反应。PBS水洗后用4%PFA多聚甲醛进行再固定，5×SSC水洗后加入预杂交液65 ℃反应1 h。加入500 ng/mL digoxigenin-labeled probe探针，暗室中65 ℃温育48 h，用封闭液温育30 min，加入生物素化鼠抗地高辛抗体，37 ℃温育1 h，加入FITC 标记抗体，暗室下37 ℃温育 30 min，DAPI染核，封片，荧光显微镜下观察染色结果。

1.6 双荧光素酶报告基因实验

构建circ_0007142与CCR8基因的野生型片段，命名为circ_0007142-WT、CCR8-WT，将野生型基因片段使用内切酶位点SpeⅠ和Hind Ⅲ扩增插入到pmirGLO双萤光素酶报告基因载体上。在circ_0007142-WT、CCR8-WT的野生型片段上设计种子序列的互补序列突变位点，命名为circ_0007142-MUT、CCR8-MUT，利用限制性内切酶与T4 DNA连接酶将突变型基因片段扩增插入到pmirGLO载体上。将这些报告质粒与miR-647 NC或miR-647 mimic使用LipofectamineTM3000试剂共转染到HEK-293T细胞中，48 h后收集细胞并进行充分裂解，离心后取上清液加入荧光素酶反应试剂，再加入细胞裂解液，最后测量萤火虫荧光素酶活性，并以肾素荧光素酶活性为标准化参考。以上详细步骤均按照试剂盒说明书进行。

1.7 RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP）实验

应用RIP试剂盒验证circ_0007142与miR-647、CCR8与miR-647的靶向关系。将细胞使用PBS水洗以后，裂解，收集裂解液进行实验，最后使用RTFQ-PCR检测circ_0007142、miR-647、CCR8的丰度。详细实验步骤按照RIP试剂盒出厂说明书进行严格操作。

1.8 Transwell实验

将冷冻的Matrigel基质胶融化，加入无血清培养基进行稀释，稀释液添加到transwell小室的上室，以5×104个细胞/孔的密度植入到上室的 24孔板中，并添加无血清培养基，下室则添加含有10%胎牛血清的培养基，37 ℃下温育24 h，多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，在显微镜下观察细胞侵袭数量。

1.9 克隆形成实验

将细胞植入6孔板，每孔5×103个细胞，置于培养箱中培养14 d，每3 d更换新培养基。培养结束后经PBS洗涤、乙醇固定后，使用0.5%结晶紫进行染色。最后在显微镜下观察细胞集落形成数量。

1.10 Western blot检测

RIPA裂解液将细胞分离提取蛋白，加入PMSF调整浓度，使用BCA定量试剂盒按照说明书要求检测蛋白浓度；蛋白在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后将其转移到PVDF膜上，再加入5%脱脂牛奶进行封闭。加入一抗vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）与膜4 ℃过夜温育，使用TBST进行冲洗，加入HRP标记的山羊抗兔二抗IgG（1∶ 1 000），室温下温育1 h。加入ECL使蛋白信号可视化，在Image J软件上进行分析。

1.11 免疫组织化学实验

石蜡切片并脱蜡至水，加入3%H2O2温育以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水和PBS冲洗，微波抗原修复，血清封闭后加入一抗CCR8，4 ℃温育过夜，PBS冲洗后加入生物素标记的二抗，室温温育30 min后PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗、脱水、透明并封片，显微镜下拍照。借助Image J软件对染色结果进行半定量分析，计算阳性表达率。

1.12 裸小鼠移植瘤实验

BALB/c裸小鼠被安置在无菌环境中饲养。对癌细胞分别转染si-NC、si-circ_0007142，之后再将细胞注射到裸小鼠右侧皮下，每隔4 d测量1次皮下肿瘤体积。35 d以后，注射异氟醚麻醉裸小鼠，断颈处死，取出肿瘤后拍照、测量体积并称重。

“不要再说啦，她的亏，我这一生吃够了，再不要在我面前提她！”说罢，蒋浩德起身要走，身体摇晃了两下，紫云一把抱住他。他回过神来，眼睛直直地望着紫云，感受到来自女人的体温，差点窒息。

1.13 统计学处理

本实验数据采用SPSS 22.0软件完成统计学分析，体外实验重复进行3次，所得结果用表示；两组间符合正态分布则采用t检验，多组间采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Circ_0007142在胃癌组织和细胞中高表达

通过RTFQ-PCR检测circ_0007142在胃癌组织和细胞中的表达，结果显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中circ_0007142显著高表达（P＜0.05，图1A）。与GES-1细胞相比，胃癌细胞系AGS、SNU-16中circ_0007142的表达都显著升高（P均＜0.05，图1B），其中AGS细胞的表达（3.47±0.29）比SNU-16（2.98±0.21）高，因此本研究选择AGS细胞进行后续功能实验。ROC曲线分析显示，circ_0007142可作为胃癌诊断的一个重要指标（AUC=0.859 8，P<0.000 1，图1C）。通过分析circ_0007142的表达与临床病理学特征的相关性可见，circ_0007142高表达与TNM分期和肿瘤浸润深度相关（P均<0.05，表2）。以上实验结果表明，circ_0007142高表达可能与胃癌发展相关。

表2 Circ_0007142的表达与胃癌患者临床病理特征关系Tab.2 Relationship between expression of circ_0007142 and clinicopathological features in patients with gastric cancer

图1 RTFQ-PCR检测circ_0007142的表达Fig.1 RTFQ-PCR was adopted to detect the expression of circ_0007142

2.2 敲减circ_0007142抑制胃癌细胞的克隆形成、侵袭和EMT

通过克隆形成实验、transwell、Western blot检测探讨circ_0007142表达水平对胃癌细胞生物学行为的影响。结果表明，与si-NC组相比，si-circ_0007142组细胞的集落形成与侵袭均被抑制（P均<0.05，图2A、B）。与si-NC组相比，si-circ_0007142组细胞中vimentin与N-cadherin的蛋白水平均下调，而E-cadherin的蛋白水平上调（均P<0.05，图2C）。以上实验说明，敲减circ_0007142的表达能够抑制胃癌细胞的集落形成能力与侵袭，并且抑制EMT的形成，进而参与胃癌的进展。

图2 敲减circ_0007142的表达能够抑制胃癌细胞恶性生物学行为Fig.2 Knockdown of circ_0007142 expression inhibits the malignant biological behavior of gastric cancer cells

2.3 在胃癌细胞中，circ_0007142可以吸附miR-647

FISH实验结果显示，circ_0007142在细胞质和细胞核均有表达，但主要定位于细胞质（图3A）。Circular RNA Interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）网站中发现miR-647与circ_0007142存在结合位点，同时设计了circ_0007142的突变位点（图3B），之后通过双荧光素酶报告基因和RIP实验验证了miR-647和circ_0007142之间的靶向作用关系，结果显示，与circ_0007142-WT+miR-647 NC组相比，circ_0007142-WT+miR-647 mimic组细胞的荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而circ_0007142-MUT+miR-647 NC组与circ_0007142-MUT+miR-647 mimic组的荧光素酶活性无显著变化（P>0.05）。RIP实验结果显示，与miR-647 NC组相比，circ_0007142在miR-647 mimic组的Ago2抗体上富集更多，circ_0007142与miR-647的靶向关系得到证实（图3C、D）。通过RTFQ-PCR发现miR-647在胃癌组织中表达较正常组织降低（P＜0.05，图3E），此外，miR-647在胃癌细胞中的表达较正常细胞同样降低（P＜0.05，图3F），胃癌组织中miR-647的表达与circ_0007142呈负相关关系（r=-0.7514，P＜0.000 1，图3G），且敲减circ_0007142能够诱导miR-647的表达（P＜0.05，图3H）。以上实验结果表明circ_0007142可以作为分子海绵吸附miR-647而发挥作用。

图3 Circ_0007142可以作为分子海绵吸附miR-647Fig.3 Circ_0007142 absorbs the expression of miR-647 as a molecular sponge

2.4 miR-647抑制剂可以部分挽救沉默circ_0007142对胃癌细胞的作用

对circ_0007142通过miR-647调控胃癌细胞的生物学行为进行研究，结果表明si-circ_0007142转染对胃癌细胞的克隆形成、侵袭和EMT有抑制作用，但该作用被miR-647 inhibitor部分挽救（P均＜0.05，图4A～C）。

图4 各组细胞克隆形成、侵袭和EMT相关因子表达Fig.4 Clone formation,invasion and expressions of EMT related factors in each group of cells

2.5 CCR8是miR-647的下游靶点且在胃癌组织和细胞中表达增强

在TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/）数据库中发现CCR8与miR-647存在结合位点，同时设计CCR8的突变位点（图5A）。双荧光素酶报告基因实验显示，与CCR8-WT+miR-647 NC组相比，CCR8-WT+miR-647 mimic组细胞的荧光素酶活性下调（P<0.05），CCR8-MUT+miR-647 NC组与CCR8-MUT+miR-647 mimic组的荧光素酶活性差异无显著变化（P＞0.05）。RIP实验结果显示，与miR-647 NC组相比，CCR8在miR-647 mimic的Ago2抗体上富集更多（P<0.05）。CCR8与miR-647的互作用关系被证实（图5B、C）。结合GEPIA（http://gepia）数据库与UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）数据库发现CCR8在胃癌组织中高表达（图5D、E）。RTFQ-PCR和免疫组织化学检测结果显示与网站预测结果一致，CCR8在胃癌组织中的表达高于正常组织（P＜0.05，图5F、G），在胃癌细胞中也得到同样的结果（P均＜0.05，图5H），相关性分析显示，CCR8的mRNA表达与miR-647表达呈负相关（P＜0.000 1，图5I）。RTFQ-PCR检测干预miR-647的表达对CCR8的影响，结果显示，过表达miR-647能够显著抑制CCR8的表达（P<0.05，图5J）。相对于inhibitor NC组，敲减miR-647的表达能够诱导CCR8表达增强，但该作用被 si_circ_0007142部分挽救（P均<0.05，图5K）。以上实验结果说明，CCR8是miR-647的下游靶点，circ_0007142能够作为分子海绵吸附miR-647进而调控CCR8的表达。

图5 CCR8是miR-647的下游靶基因且其表达受circ_0007142的调控Fig.5 CCR8 was a downstream target gene of miR-647 and its expression was regulated by circ_0007142

2.6 过表达CCR8可以部分挽救上调miR-647对胃癌细胞的作用

通过克隆形成实验、transwell、Western blot实验分析CCR8是否能影响miR-647调控的胃癌细胞生物学行为。结果发现，miR-647 mimic能够抑制胃癌细胞的克隆形成、侵袭和EMT，但该作用被OE-CCR8部分挽救（P均＜0.05，图6）。

图6 各组细胞克隆形成、侵袭和EMT相关因子表达Fig.6 Clone formation,invasion and expressions of EMT related factors in each group of cells

2.7 敲减circ_0007142可以抑制裸小鼠体内成瘤能力

本研究通过体内实验进一步验证circ_0007142对胃癌的作用。在小鼠体内注射转染了si-NC、si-circ_0007142的癌细胞，结果发现si-circ_0007142组肿瘤的体积和重量均比si-NC组低（P＜0.05，图7A～C）。以上实验数据说明，敲减circ_0007142可以抑制裸小鼠体内成瘤能力。本研究机制图见图7D。

图7 敲减circ_0007142可以抑制裸小鼠体内成瘤能力Fig.7 Knockdown of circ_0007142 inhibits tumorigenesis in nude mice

3 讨 论

胃癌的发病机制复杂，细胞生物学、分子生物学等都参与其中，在高通量测序技术与生物信息学分析高速发展的今天，对circRNA在疾病中作用的研究已经成为一大热点。EMT伴随上皮细胞标志物E-cadherin表达被抑制、间充质表型标志物vimentin与N-cadherin表达被促进，这个过程使细胞具有转移和侵袭的能力，对于癌症原发灶转移有重要的意义［16］。

CircRNA在胃癌中关于EMT和侵袭转移的机制已有研究，Jin等［17］经过研究发现，沉默circ_0101145的表达通过调节miR-548c-3p/LAMC2轴抑制肝癌EMT。Circ_0007142作为本次的研究对象，曾被发现在肺腺癌和结直肠癌中均可促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭［18-19］。本研究发现，circ_0007142在胃癌组织中呈高表达，并且功能实验显示，沉默circ_0007142可以抑制癌细胞的集落形成、侵袭和EMT，并且在体内实验中沉默circ_0007142能抑制肿瘤的生长与EMT。通过之前研究得知，circRNA可以与miRNA竞争式结合，下调miRNA的表达。借助生物学信息网站寻找circ_0007142的下游靶点，进一步选中miR-647，并使用双荧光素酶报告基因实验验证二者的靶向关系。miR-647之前被报道在胃癌耐药细胞中低表达，miR-647过表达可以降低胃癌细胞的迁移和侵袭能力［20］。Cao 等［21］通过研究认为miR-647在体内和体外均对胃癌的发展有抑制作用。本研究发现，miR-647在胃癌组织中低表达，并与circ_0007142的表达呈负相关，沉默circ_0007142对胃癌细胞的作用也可以被miR-647抑制剂部分逆转。

分析miR-647的下游靶基因发现，CCR8与miR-647之间具有相互作用。趋化因子是一类信号蛋白，可以诱导细胞定向趋化，参与血细胞发育、血管形成、细胞凋亡等过程，在肿瘤的发展、转移、炎症感染等过程中都发挥着重要作用［22］。在对浸润性膀胱癌的研究中发现，CCR8水平高与免疫耐受相关，高水平的CCR8预示着预后差，化疗效果差［23］。Li等［24］通过研究得出结论，CCR8可以作为预测胃肠道间质瘤的生物标志物，其高表达与恶性程度、不良预后相关。基于此，本研究在生物学网站中检索到CCR8在胃癌组织中高表达，借助实验进一步证实CCR8在胃癌组织中高表达。并且发现，在胃癌组织中，CCR8与miR-647的表达呈负相关，过表达CCR8可以部分抵制上调miR-647带来的影响。

基于以上分析，本次研究证明circ_0007142可能会通过miR-647/CCR8轴参与胃癌的发展，为胃癌的预防与治疗探索到新的有潜力的诊断标志物。