一株中低温除硫防腐菌的开发与分子鉴定

吴伟林，孟章进，姜桂英，王 彪，杨 帆

（1.中国石化江苏油田分公司人力资源部；2.中国石化江苏油田分公司石油工程技术研究院；3.江苏省油气微生物工程研究中心，江苏扬州，225009）

随着油田开发进入中后期，综合含水持续上升，油田系统有害微生物硫酸盐还原菌大量滋生，产生大量的硫化物和硫化氢，带来安全隐患，引起腐蚀结垢，造成油井频繁检泵作业，引起水质恶化，影响注水开发，硫酸盐还原菌和硫化物的治理尤为迫切［1］。大量研究表明反硝化细菌对硫酸盐还原菌有很好的竞争抑制［2］，其原理在于改变系统生存环境，包括氧化还原电位（Oxidation—Reduction Potential，ORP）、pH值、有机质等，使其不利于硫酸盐还原菌的生长。随着反硝化细菌抑制硫酸盐还原菌技术在国外油田成功应用，国内油田开展利用微生物来抑制或消除微生物腐蚀的生物控制技术研究越来越受到重视［3-5］。油田系统环境中的微生物往往是获取目标菌株的重要场所，而菌株的除硫效率会影响对硫酸盐还原菌的竞争抑制和油田管道设备的防腐效果。为加强油田微生物在地面污水系统的应用，开展了中低温除硫防腐菌的分离、筛选与鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

菌源：采集自JS油田不同水样。水样共计9份，编号分别为W2三相分离器出口、H4三相分离器出口、H88-1、H88-10、H88-31、W2-87、W15-17、W2-53、W11-1。以采样中微生物为菌源，分离具有除硫防腐功能的微生物。

培养基：0.2%NaNO3，0.1%葡萄糖，0.1%硫酸镁，0.5%蔗糖，0.1%酵母粉，0.5%磷酸二氢钾。

1.2 除硫防腐菌富集

不同样品中取水样100 mL，采用高速离心（12 000 r/min，15 min）对水样中微生物进行浓缩。去除上清液，沉淀用2 mL无菌水悬浮后，取1 mL悬浮液70℃水浴30 min以定向筛选对高温具有耐受能力的除硫防腐菌。将高温处理和未处理的悬浮液分别加入预先灭菌的选择性液体培养基中，置40℃恒温摇床180 r/min震荡培养48～96 h，观察培养液是否浑浊，获得样品培养富集液。光学显微镜染色观察分离微生物的形态。

1.3 除硫防腐菌的分离纯化及形态观察

用涂布法将高温处理的富集培养液均匀涂布于选择性培养基上，40℃恒温培养2～3 d，挑取单菌落接种到分离纯化培养基上，采用划线法进行分离纯化，培养12 h后，挑取单菌落涂布于选择性培养基上，获得纯化的除硫防腐菌分离菌株，平板结合显微镜检观察分离除硫防腐菌菌株的形态，确定优势菌株供进一步研究。

1.4 除硫防腐菌的分子生物学鉴定

设 计16S rDNA通 用 引 物（Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer B：5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’），以分离放线菌SR-1102 DNA为模板，采用菌落PCR方法进行16S rDNA序列扩增。PCR反应体系（50µL）：ddH2O 34µL，10×buffer 5µL，Mg2+5µL，dNTP 2.5µL，rTaq 0.5µL，Primer各1µL，模板DNA 1µL。PCR反应条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸90 s，循环33次；72℃总延伸5 min。PCR产物连接克隆载体pEASY-T3并转化大肠杆菌Top-10中。测序的16S rDNA序列与已登录Genbank数据库的基因片段进行blast比对，并利用MEGA 5.0软件比较同源性和构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 中低温除硫防腐菌的分离筛选

2.1.1样品采样和选择性富集

油田不同油井采集样品培养富集培养结果表明，H88-1和H88-31水样的培养液较空白对照浊度增加。说明培养液中均有明显的菌体增殖，显微镜观察表明培养基高温处理培养后富集液中以杆状为主，培养66 h后部分杆菌产生卵圆形孢子。而未经高温处理的浓缩液培养后产生大量球菌，66 h后培养基中几乎没有杆状菌体（见表1）。

表1 采集样品选择性富集处理筛选菌株的生长状态

2.1.2除硫防腐菌的分离纯化及形态观察

用涂布法进行分离纯化，挑取单菌落涂布于筛选培养基上，获得纯化的1株除硫防腐菌分离菌株，编号为CL-1（图1）。分离的菌株CL-1在固体培养基形成表面光滑的淡黄色菌落，菌落变异整齐无缺刻，菌落生长速度较快，24 h后菌落直径3～5 mm，菌体较粗壮，1.8µm×4.1µm～2.5µm×4.5µm，初步鉴定为芽孢杆菌属（图2）。

图1 除硫防腐菌菌株的分离纯化

图2 分离除硫防腐菌菌株的菌体形态

2.2 除硫防腐菌的分子鉴定

2.2.1 CL-1 16S rDNA序列克隆

利用细菌基因组DNA小量试剂盒（AxyPrep）抽提CL-1菌株基因组DNA。设计合成细菌16S rDNA通用引物（27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R:GCTACCTTGTTACGACTT），以 抽 提CL-1 DNA为模板，对CL-1菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增。扩增片段均一，大小在1 500 bp左右。

2.2.2 CL-1 16S rDNA的测序

对目的片段进行割胶回收，连接克隆载体pEASY-T3。转化大肠杆菌Top-10，筛选阳性克隆进行测序，对结果进行拼接，得到CL-1 16S rDNA序列大小为1 426 bp，测序结果如下：

CL-1：

TGCAAGTCGAGCGAGATTAGAAGCTTGCTTCTGACGTTA GCGGCGGAGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTG GACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCT TCATGGGAGATGATTGAAAGAGTTTCGGCTATCACTTAGATGG GCCCGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGC AACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTG AGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCGTTAGGGAAGAAC AAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGG TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGG GTCAGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAA TTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATGTGGAGGAACACCA GTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAGGTAGCCACGCCGTA AACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGC TGCAGCTAACGCATTAAGCCCGCCTGGGTACGGTCGCAAGACT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGG GACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA GTTGCCAGCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCCACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAA GACCGCGAGGTCAAGCCAATTAAAACCATTCTCAGTTCGGATT GTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAAT CGCGGATCAGCATGCGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGA GTAACCGTAAT

2.2.3基于16S rDNA序列同源性的菌株CL-1系统发育树的构建

将测序结果在NCBI上进行16 S rDNA序列同源性比对。结果显示，菌株CL-1的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性达100%，据此推测CL-1菌株属于芽孢杆菌属（见图3）。

图3 基于16S rDNA序列同源性的菌株CL-1与其它相关细菌的系统发育树

2.3 不同温度条件对除硫防腐菌生长发育的影响

不同温度条件试验结果表明，中低温除硫防腐菌的生长对温度具有一定的要求，以25～55℃为宜。在试验的25～55℃条件下培养24 h，CL-1菌株的孢子都能萌发，孢子萌发数量随温度的提高而增加。在40℃条件下培养孢子萌发率最高，平均达232 CFU/皿。随温度的提高，孢子萌发率显著下降，55℃以上孢子几乎不能萌发（见图4）。

图4 不同温度对CL-1菌株孢子萌发的影响

2.4 除硫防腐菌除硫效果评价

选取Y7-8站泵进口水样，进行模拟现场环境的室内生物除硫防腐试验，在40℃条件下投加不同浓度的除硫菌剂CL-1和硫化物抑制剂，考察水样的腐蚀速率和细菌变化。结果显示，除硫菌剂可有效除去污水中的硫化物，并且抑制硫酸盐还原菌的生长，降低污水的腐蚀速率；最优投加浓度为：硫化物抑制剂30 mg/L+0.2%除硫菌剂。

表2 Y7-8站水样实验数据

3 结论

（1）通过对JS油田水样中微生物浓缩富集筛选，分离获得了1株中低温除硫防腐菌，最适生长温度为20～55℃。rDNA鉴定结果表明，CL-1为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌。该除硫防腐菌生长旺盛、繁殖速度快，能够有效去除污水中的硫化物，抑制硫酸盐还原菌，确定为油田硫酸盐还原菌竞争抑制菌。

（2）通过中低温除硫防腐菌的筛选，可配合高温除硫防腐菌剂开发适用性强、抑制范围广的复合除硫防腐菌剂，以适应油田复杂生态系统条件下对硫酸盐还原菌的抑制，可以有效提高菌剂除硫防腐的能力，对推进生物除硫防腐技术工业化应用具有重要的现实意义。