蜂房的质量标准研究

解红霞，郝伟亮，赵炳聪，贾福群

（1.内蒙古医科大学附属医院药剂部，内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学药学院）

蜂房是胡蜂科昆虫果马蜂[polistes olivaceous（DeGeer）]、日本长脚胡蜂（polistes japonicas saussure）或异腹胡蜂（parapolybia varia fabricius）的巢[1]。目前对蜂房的研究多集中于化学成分及药理作用方面。在中医临床上，蜂房常用于治疗肺癌[3，4]、类风湿关节炎[5，6]等疾病。姚娓[7]等通过实验，验证了蜂房提取物具有抑制小鼠移植性肝癌H22肿瘤的作用。王辉[8]等以蜂房组合黄芪、苏木及其他药材进行配伍，发现其具有抑制乳腺肿瘤EMT6细胞的作用。但是蜂房的质量标准方面，如显微鉴别及薄层鉴别的文献报道甚少，缺乏可靠的参考依据，并且2020年版《中国药典》也仅收载了蜂房的性状鉴别，未收载显微、薄层鉴别以及含量测定方法。因此，本实验首次对蜂房药材的粉末特征和薄层色谱进行观察，并对其浸出物含量和没食子酸含量进行测定，测定方法快速简便，重现性好，并建立了蜂房的质量标准，旨在提高蜂房药材的质量控制水平，为蜂房质量标准的制定提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津公司），GH0525046C18A色谱柱（250×4.6mm，5μm，北京绿百草科技发展有限公司）。

1.2 试药

蜂房（内蒙古医科大学附属医院中药房，批号：121265-200301，由内蒙古医科大学药学院李骁副教授鉴定），薄层层析硅胶（青岛海洋化工有限公司，0110428）、羧甲基纤维素钠（天津威晨化学试剂科贸有限公司，20070323）、没食子酸标准品（中国药品生物制品检定所，生产批号110831-200302），蜂房对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：121265-200301），三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、无水乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 蜂房的显微特征

蜂房药材粉末为灰褐色。光学显微镜下观察可见蜂的刚毛浅黄色或黄色，散在且碎断，长30～100 μm或更长，有的先端细尖或呈V型，有的前端细尖，基部突然膨大呈囊状，有腔；蜂体壁碎片褐色或浅棕黄色，大小不等，分布散在，部分可见网状纹理，少量呈鱼鳞状，碎片偶见瘤状突起；蜂的横纹肌浅黄色，具有纹理，平直，暗带较窄；纤维呈丝状，浅黄色，单个存在，部分成束；透明条状物无色，弯曲处有褶皱；植物细胞偶见（见图1）。

图1 蜂房粉末显微鉴别图

表2 蜂房热浸法水浸出物含量

表3 蜂房冷浸法醇浸出物含量

2.2 蜂房的薄层色谱鉴别

2.2.1溶液制备[7]取蜂房药材粉末3.5 g，20倍体积水加热回流提取，滤液醇沉，浓缩上清液，加正丁醇萃取。回收有机相，甲醇溶解残渣作为供试品溶液。取蜂房对照药材3.5 g，同法制备对照药材溶液。取标准品约5.10 mg，精密称定，制得浓度为1.02 mg·mL-1的对照品甲醇溶液。

2.2.2薄层色谱分析 吸取蜂房供试品溶液、蜂房对照药材溶液和对照品溶液各约4～6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板。三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5：4：1）展开，取出，晾干，254 nm紫外灯下检视（见图2），样品分离度良好。

图2 蜂房粉末显微鉴别图

2.3 蜂房的浸出物检查

取供试品，按照水溶性浸出物测定法和醇溶性浸出物测定法（《中国药典》2015年版四部通则2201），分别采用水及乙醇作为浸出溶剂，冷、热两种浸出方法比较，测定结果（见表1~3）。结果显示，以水为浸出溶剂热浸法下，蜂房药材浸出物的平均值为14.77%，浸出效率较高。

表1 蜂房冷浸法水浸出物含量

2.4 蜂房的含量测定

2.4.1对照品溶液的制备 取标准品1.32 mg，精密称定，制得浓度为0.264 mg·mL-1的标准品甲醇溶液。

2.4.2供试品溶液的制备[8]取蜂房药材粉末约2.0 g，精密称定，加入100 mL的50%甲醇溶液，加热回流提取1 h，放冷，过滤，滤液挥干，加甲醇定容于10 mL容量瓶，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4.3色谱条件依据查阅文献及考察结果，确定色谱条件如下。采用北京绿百草科技发展有限公司GH0525046 C18A色谱柱（250×4.6 mm，5 μm），柱温室温，以甲醇-磷酸二氢钠缓冲液（pH=3.0）（5：95）为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长273 nm，进样量10 μL。色谱图（见图3、4）。

图3 没食子酸标准品溶液高效液相色谱图

图4 蜂房供试品溶液高效液相色谱图

2.4.4线性关系考察精密吸取“2.4.1”项下标准品溶 液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL，按“2.4.3”项下色谱条件进样。峰面积为X轴，标准品浓度为Y轴，得到标准曲线（见图5）。没食子酸线性考察结果表明，在5.28～47.52 μg·mL-1（R2=0.9993）浓度范围内，其峰面积与浓度的线性关系良好。

图5 没食子酸标准曲线图

2.4.5精密度试验精密吸取标准品溶液10 μL，按“2.4.3”项下色谱条件连续进样6次。记录没食子酸的色谱峰面积。结果显示，没食子酸峰面积RSD（n=6）为0.33%，精密度良好。

2.4.6稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.4.3”项下色谱条件在0、2、4、8、12、24 h分别进样6次，测定峰面积RSD（n=6）为1.58%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.7重复性试验取同一批蜂房药材6份，精密称定，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进样，测得没食子酸平均含量为1.25 mg·g-1，RSD为1.85%。

2.4.8加样回收率试验称取已知含量的“2.4.7”项下蜂房药材6份，每份约1.0 g，精密称定。每份分别精密加入没食子酸标准品3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，按“2.4.2”项下方法制成样品溶液，在“2.4.3”项下色谱条件进样，记录色谱峰的面积。平均回收率测定结果（见表4）。

表4 加样回收率试验结果（n=6）

2.4.9蜂房样品的含量测定取蜂房药材粉末三份，每份约1.0g，精密称定，按“2.4.2”项下方法制备成蜂房样品溶液，在“2.4.3”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算蜂房样品液中没食子酸含量（见表5）。

表5 蜂房样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相的选择[9~13]

本实验分别考察五种流动相体系（见表6）。分别按照上述条件等度洗脱后，结果显示，pH值为3，配比为5：95的甲醇-磷酸二氢钠缓冲液作为流动相时色谱峰分离情况较好，故选该体系为流动相。

表6 流动相条件表

3.2 紫外检测波长的选择

按照《中国药典》2015年版三部制剂通则0401制备没食子酸标准品稀释液，于200-800 nm波长范围内进行全波长光谱扫描，在273 nm附近没食子酸吸光系数最大且干扰较少，故选择273 nm作为吸收波长。

3.3 色谱条件的选择

色谱条件优化时，查阅相关文献，水相中多用的纯水相或加有磷酸或乙酸。本实验发现，水相中加入磷酸二氢钠且将PH值调为酸性，分离效果明显，且基线稳定。实验中出现等度洗脱分离时间较长，杂质峰分离度较差现象，因此进行梯度洗脱。梯度洗脱时，混合对照品能很好的分离，但因为初始浓度不同，出峰位置不同，分离效果不同，经过多次实验对比筛选，最终选定以35%有机相开始进行梯度洗脱。

3.4 小结

本试验对蜂房的显微、薄层特征进行鉴别，对其浸出物及没食子酸含量进行了测定，以期为蜂房的质量控制以及质量标准的完善提供些许帮助。