超声辅助提取玉木耳黄酮工艺优化研究

张思覃

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

玉木耳是毛木耳白色变异菌种，遗传稳定、优质高产，是药食两用真菌［1-2］。黄酮是玉木耳中主要活性成分，具有抗菌抗癌、降压降脂及延缓衰老等功效，在医药和食品领域具有良好的应用前景［3-4］。

超声波辅助提取作为一种新型提取技术，与传统提取技术相比具有操作方便、溶剂用量少、选择性强、产物易于纯化等优点[5-6］。响应面分析法是应用合理的实验设计，采用多元二次回归方程拟合各个因素与响应值之间的函数关系，利用回归方程分析寻求最优工艺参数，在各种工艺优化设计中得到广泛 应 用［7-9］。

本试验采用微波辅助法对玉木耳中的总黄酮进行提取，在单因素实验基础上，研究响应面法优化微波辅助提取玉木耳中总黄酮的最佳工艺条件、优化玉木耳总黄酮的提取工艺、提高玉木耳的使用价值，促进玉木耳资源的有效开发利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉木耳干品购自安徽砀山，烘干粉碎，过筛备用；芦丁标准品(上海源叶生物科技有限公司)，其他相关试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 玉木耳的预处理。将玉木耳洗净，晾干，于烘箱中55℃干燥至恒重，粉碎，先后过3号和5号药典筛、装瓶备用［10］。

1.2.2 绘制芦丁标准曲线。参考郭亚健方法[11]：精密称取干燥至恒重的芦丁标准品25 mg，置50 mL容量瓶，75%的乙醇定容，得芦丁标准溶液，取不同体积标准溶液，置于100mL容量瓶中，进行反应，510 nm处测定吸光度A。以芦丁浓度为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线[12]，得到标准曲如图1所示。

图1 卢丁标准曲线

1.2.3 玉木耳黄酮类化合物的提取和测定。准确称取经处理的玉木耳粉1.00 g，置于250 mL磨口烧瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，在一定的微波功率下加热一定时间后过滤，吸取2.00 mL滤液于50 mL容量瓶中，进行稀释定容至50 mL，作为待测液备用[13]。

按照标准曲线方法处理，将吸光度（A）代入芦丁回归方程公式中，得到黄酮浓度（C），计算样品的总黄酮提取率，公式如下。

总黄酮提取率（%）=C×V×N×100/M；C：粗提取样液中总黄酮的浓度（mg/mL）；V：提取液体积（mL）；N：稀释倍数；M：植物粉末样品质量（g）[14]。

1.2.4 单因素试验设计。采用控制变量法，选取液料比、超声时间、超声温度、超声功率、乙醇浓度等进行单因素试验，研究不同因素对玉木耳总黄酮提取率的影响。

1.2.5 响应面优化设计。综合单因素试验得出的结果，选取超声时间、超声温度、超声功率、乙醇浓度4个因素，利用Design Expert软件进行CCD响应面设计玉木耳总黄酮的提取工艺［15-16］。试验方案如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对玉木耳总黄酮提取率的影响。由图2可以看出，玉木耳总黄酮的提取率随着料液比呈递增趋势，当料液比达到1:16（mL/g）时,玉木耳总黄酮提取率达到最大值后，随着液料比的增大玉木耳总黄酮提取率下降。因此，选择最佳料液比条件为1:16（mL/g）。

图2 料液比对玉木耳黄铜提取率的影响

2.1.2 超声时间对玉木耳总黄酮提取率的影响。由图3可知，在设定时间范围内，玉木耳总黄酮提取率随着提取时间延长而增加，当超声提取时间超过70 min，总黄酮提取率呈下降趋势。根据分析，这可能是因为随着超声时间的增加，溶液温度不断升高，样品内分子的运动速度加快，使得玉木耳中总黄酮更易提取。时间过长超声处理造成黄酮结构的破坏，造成提取率下降。综合考虑，确定较适合的提取时间为70 min左右。

图3 超声时间对玉木耳黄铜提取率的影响

2.1.3 超声温度对玉木耳总黄酮提取率的影响。由图4可知，在选择的温度范围内，小于70℃范围提取率随温度增加而增加，70℃时提取率最大，提取温度高于70℃提取率出现下降的趋势，这可能是由于提取温度过高时，黄酮类化合物的结构受到破坏，因此选择70℃为提取玉木耳黄酮的最佳温度。

图4 超声温度对玉木耳黄铜提取率的影响

2.1.4 超声功率对玉木耳中总黄酮提取率的影响。由图5可知，超声功率低于80 W时，玉木耳总黄酮提取率随着功率的增加而递增，80 W时，玉木耳总黄酮的提取率达到最大值。超声功率大于80时，玉木耳总黄酮提取率下降。根据分析，这可能是因为在较大功率下部分黄酮被分解。因此，选择最佳微波功率为80 W。

图5 超声功率对玉木耳黄铜提取率的影响

2.1.5 乙醇浓度对玉木耳总黄酮提取率的影响。由如图6可知，乙醇浓度为70%时，玉木耳总黄酮提取率达到最大值。乙醇浓度大于70%，随着乙醇浓度的增加，玉木耳总黄酮提取率呈下降趋势。根据分析，这可能是因为一些极性物质的溶出，从而影响玉木耳总黄酮溶出，因此选择最佳提取乙醇体积分数为70%。

图6 乙醇浓度对玉木耳黄铜提取率的影响

2.2 响应面法优化玉木耳总黄酮提取工艺参数

2.2.1 回归方程的建立与分析。在单因素试验的基础上，利用响应面分析法优化玉木耳总黄酮的提取工艺。选取超声时间（A）、超声温度（B）、超声功率（C）、乙醇浓度（D）4个因素，以玉木耳总黄酮提取率为响应值(Y)，采用Design-Expert 7.1.3进行选用CCD进行响应面设计和分析，试验结果见表2，模型方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计表

通过对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得出拟合方程式:y=0.75-0.0016A-0.027B-0.037C-0.012D-0.0075AB-0.045AC+0.0025AD-0.0075BC-0.01BD-0.012CD-0.022A2-0.062B2-0.1 C2-0.032D2。

从表3可以看出该模型回归显著（F=20.62，P＜0.0001），即建立的回归模型有意义；失拟项P=0.0631，没有显著差异；确定系数R2=0.9538，调整系数RAdj2=0.9075，说明该模型能够较好的拟合实际实验。回归模型中由一次项的P值（A：0.7771，B：0.0004，C：＜0.0001，D：0.0629）可以说明选定的超声水浴温度和超声功率可显著影响玉木耳总黄酮提取率，超声时间和乙醇浓度对玉木耳黄酮提取率的影响并不显著；各因素二次项均为模型极显著因素；交互项AC为模型显著因素，其他各因素交互模型不显著因素，不能明显影响玉木耳黄酮提取率。另外，从各项的F值（A∶0.083，B∶21.33，C∶40.33，D∶4.08）可以看出，各因素在所选的水平范围内，黄酮提取率的影响由大到小依次为：超声功率、超声温度、乙醇浓度、料液比。

表3 方差分析表

2.2.2 响应面分析。模型响应面图结果见图7~12，各图显示超声时间、超声温度、超声功率、乙醇浓度中任意两个变量取零水平时，其余两个变量对玉木耳总黄酮提率的影响。从3D响应面图中能够比较明显的分析出多个自变量对响应值的影响，并且可以通过图形分析响应面对不同自变量变化之间的影响程度，在保持其中一个自变量不变的前提情况，其他两个自变量对响应面值的影响。

图7 超声时间与超声温度及其交互作用对玉木耳总黄酮得率影响的响应面

如果响应曲面坡度越陡，说明响应值对于操作条件的改变越敏感，反之如果响应曲面的坡度越平缓表明操作条件的改变对响应值的影响也就越不显著[17-19]。通过对图8~图13的分析可知，图9中响应曲面坡度陡，等高线呈椭圆形，AC的交互作用对玉木耳总黄酮提取影响显著。当提取时间一定时，黄酮提取率随提取功率增加呈先增加后减少的趋势。当超声功率一定时，总黄酮提取率随着提取超声时间的增加呈先增加后减少的趋势。

图8 超声时间与超声功率及其交互作用对玉木耳总黄酮得率影响的响应面

图9 超声时间与乙醇浓度及其交互作用对玉木耳总黄酮得率影响的响应面

图10 超声温度与超声功率及其交互作用对玉木耳总黄酮得率影响的响应面

图11 超声温度与乙醇浓度及其交互作用对玉木耳总黄酮得率影响的响应面

图12 超声温度与超声功率及其交互作用对玉木耳总黄酮得率影响的响应面

其他因素间的交互作用，在选择的因素的范围内，交互作用效果不显著。

2.2.3 最佳工艺条件的预测和验证。经响应面分析优化，通过Design-Expert软件对回归方程进行数据处理，获得微波辅助提取莪术总黄酮的最佳工艺条件为：超声时间为67.9 min、超声温度为67.9、微波功率为77.9 W、乙醇浓度为69%，在这种条件下模型预测玉木耳总黄酮提取率为0.757（%）。

在考虑到实际操作条件中局限性和便捷性，对提取玉木耳总黄酮最佳的工艺条件修正为超声时间为68 min、超声温度为68、微波功率为78 W、乙醇浓度为69%。按照优化后的工艺条件进行了5次平行验证实验，实际得到的玉木耳总黄酮平均提取率为0.753（%）。玉木耳总黄酮的提取率与所建立模型预测的玉木耳总黄酮提取率相差不大，表明实验结果与模型拟合良好，说明优化工艺条件准确可靠，具有较好的可行性。

3 结论

以干燥粉碎玉木耳粉为原料，加入乙醇溶液，利用超声辅助提取，在单因素实验的基础上，利用响应面法优化了提取工艺条件。可得超声辅助提取玉木耳总黄酮的最佳工艺条件为：超声时间为68min、超声温度为68、微波功率为78W、乙醇浓度为69%，在此条件下实际测定出玉木耳总黄酮平均提取率为0.753（%）。