亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰研究中的应用进展

顾晨露，王启晓，田胜，李秀，童珊珊

(江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013)

蛋白质糖基化是蛋白质重要的翻译后修饰之一，多种生物学功能都与其相关。蛋白质糖基化可分为两类：N-糖基化和O-糖基化。一般来说，N-多聚糖附着在由Asn-X-Ser/Thr组成的特定氨基酸序列基序上，X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。O-多聚糖与丝氨酸或苏氨酸相连，没有任何特定的氨基酸序列基序。此外，N-聚糖有一个共同的核心结构，由GlcNAc2Man3组成，而O-聚糖则有多个核心结构[1-2]。由于糖基结构的多样性，蛋白经糖基化修饰后结构明显更加复杂。蛋白质糖基化的复杂性不仅在于聚糖结构中单糖组成的改变，而且在于立体化学和糖基化位点的复杂多变[3]。多聚糖在细胞间通讯、细胞运输、蛋白质溶解等细胞过程中发挥重要作用[4]。蛋白质糖基化可改变蛋白质功能，糖基化过程的失调或紊乱与癌症[5]、炎症性疾病[6]、神经系统疾病[7]等相关，如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)。AD的主要病理特征为神经纤维缠结和淀粉样斑块。神经纤维缠结由磷酸化的tau蛋白组成，斑块由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)组成[7]。Sato等[8]通过单糖组成分析证实tau蛋白存在N-糖基化；Jacobsen等[9]也证实，O-糖基化导致APP生成过程中α型可溶性APP水平增加。

基于糖基化蛋白成分及结构的复杂性，准确地对糖基化蛋白定性、定量或糖基化位点分析，对于疾病标志物的精准检测、进一步从分子层面揭示疾病发生的机制显得相当重要。近年来发展了许多分析技术应用于糖蛋白分析，如糖蛋白质组学、表面等离子体共振成像法、多重质谱等。

然而生物样品中糖基化蛋白质相对丰度低，样品基质复杂，故而适宜的分离技术必不可少。亲和技术具有良好的专一性和灵敏度，可有效实现蛋白质的分离富集，其已成为糖基化蛋白质结构与功能研究的有力工具，并在近期得到发展。亲和分离技术是基于配基与底物之间的专一的可逆性结合，选择性分离检测目标物的分离分析手段，在复杂的生物大分子分析中显示出卓越的优异性。由于细胞内或生物基质中糖基化蛋白质的含量普遍很低，质谱通常是分析蛋白质糖基化的首选方法[10]。在质谱分析之前，往往需要富集浓缩以降低背景干扰，提高亲和分离效率。亲和分离糖基化蛋白以实现富集目的，提高了糖基化蛋白质鉴别的专一性和灵敏度。本文在近年来蛋白质糖基化研究的基础上，对糖蛋白分析的亲和材料和方法进行总结。

1 凝集素亲和层析与凝集素芯片技术

目前已发现一千多种植物凝集素，王钰清等[11]归纳了植物凝集素的类别，一般根据碳水化合物的结合特异性，可将凝集素分为D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基半乳糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-岩藻糖凝集素和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)凝集素。与抗体不同，凝集素是一类非免疫来源的特异性糖蛋白，且其具有的糖结合位点能识别糖蛋白和糖肽中复杂的糖基结构[12]，因此凝集素对含特异性糖基结构的糖蛋白具有特异性的分子识别能力。

研究人员不断尝试设计一种良好的凝集素亲和载体以选择性分离糖蛋白，主流方法一般在琼脂糖基质上应用固定化凝集素[13]。这种基质的主要缺点是由于流速和回流压力的限制，色谱条件受到严重限制。样品往往需要预处理，大大增加了分析时间和样品丢失的风险，从而影响分析结果。近年来，将凝集素固定于二氧化硅载体上，可制备出具有良好色谱性能的高压凝集素柱。然而，二氧化硅微球的pH值限制和非特异性吸收是该研究的技术瓶颈[14]。多孔二氧化硅在碱性pH值下可被溶解，且其表面存在的硅醇基团可能作为潜在的离子交换位点，影响色谱柱的专属性，因此，在基质与配基偶联之前，必须对基质表面进行额外的衍生化修饰。以Madera等[15]研究为代表，首先经过一系列的工作，制得醛改性二氧化硅微球，再利用还原性胺化反应与凝集素偶联，制得凝集素-二氧化硅亲和色谱填料。基于还原胺化的蛋白质和醛改性二氧化硅材料的化学结合，反应非常快速。虽然常用的偶联反应大多是在4℃过夜进行，以增强配基的稳定性，但该反应在室温下偶联效果较好，偶联率较高，且对凝集素结合活性无明显不良影响。此外，李凤等[16]以Fe3O4为磁性粒子与二氧化硅合成出一种新型的磁性纳米粒子，伴刀豆凝集素A以共价键的形式交联在粒子表面，应用于人血清中特异性糖蛋白的亲和富集。

利用凝集素亲和性，可以根据糖蛋白的特性，很容易地分离结构异构体和寡糖。凝集素亲和色谱在蛋白质组学分析之前可以针对特定类型的糖蛋白，有效地简化复杂的样品[17]。此外，凝集素亲和色谱已用于结合多种糖蛋白，并可以用于识别疾病标志物[18]。大量研究证实，缺糖基转铁蛋白是诊断酒精性肝病的实验室指标[19]。allo-A凝集素可与含有四唾液酸转铁蛋白残基的寡糖结合。在以allo-A凝集素建立的亲和层析中，由于缺糖基转铁蛋白缺失某些糖基末端链，以低亲和力与allo-A结合，缺糖基转铁蛋白在适宜的洗脱条件下可通过层析柱，而正常转铁蛋白则与层析柱内的allo-A凝集素结合滞留于层析柱内[20]。allo-A亲和层析技术用于缺糖基转铁蛋白的初步分离，实现其有效检测，为酒精性肝病的诊断与治疗提供了依据。

然而，基于凝集素特异性结合碳水化合物结构的特性，凝集素亲和层析只能选择性地富集单一类型的聚糖结构。例如，伴刀豆凝集素A选择性结合具有甘露糖单元的多糖[21]，黑参凝集素选择性结合具有N-乙酰神经氨酸(唾液酸)单元的多糖[22]，橙黄网胞盘菌凝集素选择性结合具有海藻糖单元的多糖[23]。凝集素分离的主要缺点是，对于任何单一凝集素，只能纯化具有特定糖基的单一糖肽。为了克服这个问题，使用凝集素的组合来进行更广泛的聚糖富集。Guo等[24]使用凝集素芯片检测丙型肝炎病毒(HCV)粒子，以期获得HCV粒子的N-聚糖谱；37个凝集素中有32个显示出阳性结合信号。其中，有4个凝集素的荧光强度较强，尤其雪花莲凝集素信号最强，表明高甘露糖型N-聚糖是HCV粒子的主要糖基化形式； 10个凝集素与半乳糖/N-乙酰半乳糖胺结合，表明HCV粒子存在半乳糖基化的N-聚糖和O-链聚糖。凝集素芯片的应用克服了单一凝集素选择性结合的缺陷，有望用于高通量的聚糖筛选。

2 免疫沉淀技术

免疫沉淀可用于如血浆、细胞系、组织等生物基质，以富集特定的糖蛋白，应用于后续精密仪器分析，从而全面表征特定的糖蛋白。如图1所示的分析策略，目标糖蛋白经免疫沉淀技术从复杂生物基质中分离，经酶消化，再加入碘甲烷等甲基化试剂使糖链甲基化，以应用于质谱等进行糖基化位点分析。

注：CID-MS/MS引用文献[25]图1 免疫亲和纯化糖蛋白及后续分析策略

Wang等[25]将该项技术用于分析肺癌细胞中的触珠蛋白；抗体于肺癌患者血浆中孵育以去除血浆中免疫球蛋白，从而富集触珠蛋白进行后续实验。同样，免疫沉淀富集分离技术也经Tsai等[26]用于肺癌患者血清样本中生物标志物的筛选。然而，由于该方法依赖于特定抗体来识别目标糖蛋白，应用范围较局限。

3 固定金属离子色谱-亲水作用色谱同步分离技术

以金属离子为配基的色谱分离技术又称固定金属亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)，其色谱基质共价耦合某些能螯合金属离子的化合物，而被特定螯合的金属离子能与某些蛋白质表面暴露的氨基酸残基(主要是组氨酸)配位结合，从而实现对特定蛋白质的分离检测。发展至今，研究者在前人基础上不断改革创新，使IMAC具备蛋白负载能力高、配基稳定、洗脱条件温和、成本低和再生简单等优点。特别是IMAC的高选择性使得其成为分子生物学研究中纯化蛋白质的标准技术[27]。在亲和填料方面，为获得理想的选择性并且减少金属离子解吸附，学者们开发多种IMAC配基，可分为四种类型：(1)双齿配基，如氨基羟肟酸[28]；(2)三齿配基，如亚氨基二乙酸[29]；(3)四齿配基，包括氮三乙酸和羧甲基天冬氨酸[30]；(4)五齿配基，如四乙烯戊胺[31]。

IMAC和亲水作用色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)作为可应用于同时富集磷酸化蛋白和糖基化蛋白的技术手段，近年来取得较大进展。Zhang等[32]利用Fe3+固定化离子色谱选择性富集糖肽类和磷酸肽类，并在HILIC模式下进一步分离。IMAC-HILIC技术优点在于能够同时对蛋白质磷酸化和糖基化进行分析，对于阐明蛋白的生物功能非常重要。在Zhang等[32]的研究中，糖肽和磷酸肽得到很好的富集，甚至从α-酪蛋白、胎球蛋白和牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化物中成功分离出两个馏分。将建立的方法应用到HeLa细胞裂解液中，分离检测出1 903个磷酸肽和141个糖基化位点。由此表明，该方法可以选择性、同时富集和分离肽混合物中的糖肽和磷酸肽。

4 硼酸亲和整体柱及硼酸亲和磁性纳米粒

由于硼酸反应的专一性，硼酸盐亲和材料近年来受到越来越多的关注。已证实硼酸盐亲和材料可以有效分离包括糖蛋白在内的含顺式二羟基结构的化合物[33]。硼酸分子与糖链上的顺式二羟基结构在碱性条件下形成环酯，该生成物在酸性条件下容易水解[34]，反应原理如图2所示。基于该可逆反应，可利用硼酸盐亲和材料选择性检测分离富集糖基化蛋白。将硼酸盐亲和配体固定于整体柱[35]、磁性纳米粒[36]等载体，以实现对糖蛋白的分离富集。

图2 硼酸盐材料亲和分离顺式二羟基化合物原理图

基于间氨基苯基硼酸(m-aminophenylboric acid, m-APBA)固定在琼脂糖凝胶上的商业化硼酸盐亲和材料，可用于糖尿病相关的糖基化蛋白和糖基化肽分离[37]。然而，m-APBA与含有酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸残基的肽之间存在一些非特异性作用，这将极大地影响该方法的分离效率[38]。为此，研究者将多种新型硼酸分子应用于糖蛋白的分离富集，主要包括硼酸的杂环类似物、苯基上连有吸电子基的取代苯硼酸等[39]。例如，3-丁烯基磺酰基-苯基硼酸整体毛细管柱可在中性pH位点亲和结合核苷和糖蛋白[39]。

另一种硼酸亲和分离糖基化蛋白的策略是将聚合硼酸与磁性纳米颗粒结合，增强硼酸亲和材料与糖蛋白的结合能力。Huang等[40]以唾液酸为模板，3-氨基苯基硼酸为功能单体，甲基丙烯酸甘油酯为共聚单体，制备硼酸亲和磁性中空分子印迹聚合物。中空结构使得化学吸附的Fe3O4纳米颗粒在内外表面有更多的结合位点，有利于模板分子从聚合物中脱除，增强对唾液酸的吸附能力。在最佳条件下，唾液酸的检出限为2.5 ng/mL。该方法用于分析不同加标水平的血清样品时，唾液酸的加标回收率为71%～106%。由此表明，硼酸亲和磁性中空分子印迹聚合物对复杂基质中痕量唾液酸的选择性和高效富集的优越性，证实多价结合策略的可行性。

5 小结与展望

近年来，随着糖蛋白组学研究的发展，使用凝集素亲和、免疫沉淀、离子色谱、硼酸亲和等分离富集技术实现了低丰度糖蛋白的检测，成为糖基化蛋白质结构与功能研究的有力工具。尽管凝集素亲和层析技术只能选择性地富集单一类型聚糖结构的糖蛋白，但凝集素芯片技术的应用实现了特定糖基结构的高通量筛选；免疫沉淀技术的应用实现了血浆等复杂基质中的糖蛋白分离富集；固定金属亲和色谱的应用实现了磷酸化蛋白和糖基化蛋白的在线同步分离检测；硼酸亲和技术除了分离糖蛋白还可分离含顺式二羟基结构的化合物，改性硼酸的合成解决了硼酸亲和材料碱性工作环境易使糖蛋白水解的问题，聚合物载体的引入扩增了硼酸配体的数目，从而提高了该亲和材料对糖蛋白及糖肽的亲和力，但合成过程中模板的选择、功能单体及共聚单体的加样比，以及合成路线对硼酸亲和材料性能有较大影响。亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰研究中的总结与展望如表1所示。

表1 亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰研究中的总结与展望

此外，糖蛋白通常有多个糖基化位点，这复杂化了位点特异性糖基化的表征。为获得糖蛋白的微观异质性信息，亟须在亲和分离技术的基础上开发出专一性更好、灵敏度更高的检测手段来获取肽主链、糖基化位点等信息，从而揭示蛋白质糖基化修饰的生物学效应。