荧光免疫层析法不同时间检测糖化血红蛋白的结果分析

肖中华

江西省抚州市乐安县人民医院检验科，江西抚州 344300

随着我国社会经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病的发病率及患病率逐年升高，严重威胁我国人民的健康。糖化血红蛋白(HbA1c)可反映受检者检测前120 d内的平均血糖水平，能准确反映糖尿病患者长期的血糖控制水平，且不受采血时间、是否空腹、是否使用胰岛素等因素干扰。在美国、欧盟、澳洲及日本等国家和地区已将HbA1c列为糖尿病的诊断和监测指标，在我国其被推荐用于糖尿病诊断及诊断标准的相关研究[1-2]。同时也有研究报道，将HbA1c与其他项目联合检测用于相关疾病的诊断、鉴别与疗效评估具有较高的应用价值[3-4]。荧光免疫层析法作为HbA1c检测方法之一，因其融合了胶体金免疫层析技术的定量检测方法，具有操作简单、携带方便、检测速度快等优点[5-6]，已被当作床旁检测(POCT)项目广泛应用于各基层医院实验室及病房，但其不需要专业人员操作就可以得出检测结果，容易因操作不规范，从而影响检测结果的准确性。笔者通过荧光免疫层析法对不同HbA1c水平标本进行检测，检测过程中对各步骤设置不同时间，发现不同HbA1c水平标本加入标本稀释液后混合作用不同时间的检测结果，以及标本稀释混合液加入检测板后在不同时间进行检测的结果均存在一定的差异，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 (1)质控品2份：水平1(批号191018，靶值5.0%)和水平2(批号191018，靶值9.7%)质控品均由广州万孚生物技术股份有限公司提供。(2)收集15份糖尿病患者乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝全血标本(2～8 ℃保存7 d内的患者标本，标本的HbA1c水平取值于按标本按试剂盒说明书标准操作程序检测2次的均值)，其中HbA1c<6%的标本5份(设为HbA1c低值组)，HbA1c为6%～10%的标本5份(设为HbA1c中值组)，HbA1c>10%的标本5份(设为HbA1c高值组)。

1.2仪器与试剂 万孚飞测Ⅲplus免疫荧光检测仪、HbA1c检测试剂盒(荧光免疫层析法，批号：W20714606A)均购自广州万孚生物技术股份有限公司。

1.3检测方法 (1)方法A：严格按照HbA1c检测试剂盒说明书进行标准操作，取试剂、标本在室温下平衡，取10 μL血液标本加入标本稀释液中混匀作用1 min后，取75 μL标本稀释混合液加入检测板，5 min后立即进行检测。依次对定值质控品水平1、水平2及15份不同HbA1c水平的全血标本进行检测，并记录结果作为对照。(2)方法B：将上述试剂盒说明书标准操作步骤中的标本与稀释液作用时间，设置为不同时间再分别按作用时间吸样加入检测板作用5 min后立即检测，记录结果，并与标准操作(方法A)检测结果进行比较。(3)方法C：按说明书标准操作步骤制备标本，与稀释液混合作用1 min的标本混合液加入检测板，设置不同检测时间进行检测，记录结果，并与标准操作(方法A)检测结果进行比较。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理及统计分析。不同步骤作用时间之间检测结果采用单变量方差分析法进行比较；不同HbA1c水平分组之间的检测结果先与样品水平标示值比较算出偏倚值(取其绝对值)，再将偏倚值进行单变量方差分析法比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1方法A与方法B检测不同水平HbA1c的结果比较 (1)标本加入稀释液混合作用1 min (标准操作)检测结果与混合作用3、5 min检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与混合作用10～60 min检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)质控品水平1与HbA1c低值组、HbA1c中值组偏倚值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与HbA1c高值组偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)质控品水平2与HbA1c低值组、HbA1c中值组偏倚值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与HbA1c高值组偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(4)HbA1c低值组与HbA1c中值组偏倚值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与HbA1c高值组偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(5) HbA1c中值组与HbA1c高值组偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。具体作用时间及检测结果见表1，HbA1c低值组、HbA1c中值组、HbA1c高值组和不同水平质控品偏倚值结果见表2。

表1 各标本分别用方法A和方法B检测的HbA1c水平(%)

表2 方法B检测HbA1c水平与样品水平标示值比较的偏倚值(%)

2.2方法A与方法C检测不同水平HbA1c的结果比较 (1) 标本稀释混合液加入检测板后5 min (标准操作)检测结果与加入检测板后10、15、20 min检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与加入检测板后25、30、60 min检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)质控品水平1与HbA1c低值组偏倚值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与HbA1c中值组、HbA1c高值组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)质控品水平2与HbA1c中值组、HbA1c高值组偏倚值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与HbA1c低值组偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(4)HbA1c低值组、HbA1c中值组、HbA1c高值组间偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(5) 质控品水平1与水平2 偏倚值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。具体检测时间及检测结果见表3，HbA1c低值组、HbA1c中值组、HbA1c高值组和不同水平质控品偏倚值结果见表4。

表3 各标本分别用方法A和方法C检测HbA1c水平(%)

表4 方法C检测HbA1c水平与样品水平标示值比较的偏倚值(%)

3 讨 论

荧光免疫层析法是利用荧光免疫技术，结合层析法和免疫法的特点，采用夹心法检测HbA1c在人体血液中的百分比。检测原理：标本中的HbA1c、血红蛋白(Hb)分别与包被在硝酸纤维素膜上的荧光标记HbA1c单克隆抗体、荧光标记Hb单克隆抗体结合，在层析作用下反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前扩散，被固定在硝酸纤维素膜检测线上包被的HbA1c抗体、Hb抗体结合，血液标本中的HbA1c抗原、血红蛋白(Hb)抗原水平与荧光信号强度呈正相关，通过荧光检测仪检测荧光信号强弱计算得出HbA1c占Hb的比值[3-6]。

大量的文献对国内HbA1c的检测方法和分析仪器进行比较[6-11]，并对HbA1c的检测现状进行了阐述，其中高效液相色谱法被认为是检测HbA1c最稳定和准确的参考方法。有研究者用其他方法与高效液相色谱法进行对比分析，其中曹东林等[5]和ANG等[6]都对荧光免疫层析法与高效液相色谱法进行了比较，发现二者检测结果有较好的一致性。

本研究结果显示，荧光免疫层析法在检测全血标本HbA1c的过程中，标本与标本稀释液混合作用时间在1～5 min内进行检测，对检测结果无影响(P>0.05)，作用时间延长至10 min以后，HbA1c水平越高的标本随着标本稀释液作用时间的延长，检测结果逐渐降低，与标准操作(1 min)检测结果差异有统计学意义(P<0.05)，这可能与标本稀释液中含有十二烷基硫酸钠(SDS)有关，SDS是一种阴离子表面活性剂，可使红细胞膜崩解，释放Hb(含HbA1c)，当其与Hb作用一定时间后，可能也会改变Hb的构象，其抗原性也相应发生改变，但真正的原因有待进一步做相关研究来证实。有相关研究报道，一定水平的SDS与Hb作用后，可使Hb变性，空间结构发生变化，随着SDS溶液水平的增加，蛋白质去折叠的程度加大，构型发生进一步变化[10-11]。

本研究还发现，标本稀释混合液加入荧光免疫层析检测板后作用 5～20 min内进行检测，对检测结果无影响(P>0.05)，检测时间延长至25 min以后，HbA1c水平越高的标本随着检测时间的延长，检测结果也逐渐降低，与标准操作(5 min)检测结果差异有统计学意义(P<0.05)，这应该与荧光强度随时间的延长而自然衰减有关。

综上所述，荧光免疫层析法以其不需要昂贵设备、操作简单、携带方便、检测速度快等优点为基层医院开展HbA1c检测带来了便利，但在检测过程中应严格遵守操作标准，并在合理的时间内完成检测，否则可能造成检测结果不准确，对临床疾病的诊断和治疗无参考价值，甚至误导临床，延误患者病情，严重者可能危及患者生命。