miR-181b-3p在胃癌患者血清中的表达及其靶基因预测

陈木龙，陈红虹

广东省梅州市第二中医医院检验科，广东梅州 514011

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，其病死率在全球癌症中位居第二位，每年全球新增患者约100万，中国占42%，全球死亡人数约80万，中国占35%[1]。胃癌Ⅰ期患者5年生存率可达90%，而Ⅳ期患者5年生存率仅为5%[2]。目前，对胃癌的早期诊断及治疗方案的选择均缺少有指导意义的特异性指标，从而导致胃癌的5年生存率并无明显改善。因此，探索能反映胃癌发生、发展情况的标志物，对早期防治胃癌和改善胃癌预后具有重要意义。微小RNA(miRNA) 是长度为19～24个核苷酸的内源性短链RNA，在个体发育、细胞分化、增殖及凋亡等过程中起重要调控作用。近年来有研究发现，人类30%以上的蛋白质编码基因可能受miRNA的调控，大约50%的miRNA位于肿瘤相关的基因组区域，广泛参与肿瘤发生，因此，miRNA可以作为临床辅助诊断肿瘤和预后判断的分子标志物[3]。miR-181b-3p在不同类型肿瘤中的研究均有报道，例如miR-181b-3p在非小细胞肺癌[4]、星形细胞瘤[5]中低表达，但在乳腺癌[6]、骨肉瘤[7]中高表达。本研究通过分析胃癌患者血清中的miR-181b-3p相对表达水平，以及诊断效能，为寻找有效的胃癌诊断生物标志物提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2019年6月至2020年6月收治的胃癌患者35例作为研究组，其中男23例，女12例；平均年龄(57.51±6.84)岁。同期健康志愿者45例作为对照组，其中男25例，女20例；平均年龄(56.71±6.87)岁。胃癌患者均经胃镜病理检查确诊，且均为初诊；近3个月未规律服用过抑酸药、胃黏膜保护剂、非甾体类药物、抗菌药物。

1.2试剂 总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。miR-181b-3p和内参U6引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3检测方法 采集所有研究对象空腹外周静脉血5 mL，在2 h内离心15 min(3 000 r/min、室温)，分离出血清作为标本，置于-80 ℃冰箱中保存备用。取血清，加入Trizol进行裂解。总RNA提取根据总RNA提取试剂盒说明书步骤进行。测定所提取的RNA水平后，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用RT-PCR试剂盒进行PCR扩增。U6为内参。用2-ΔΔCt法计算血清miR-181b-3p的相对表达水平。

2 结 果

2.1两组血清中miR-181b-3p相对表达水平比较 对照组与研究组miR-181b-3p相对表达水平分别为1.01±0.31、1.89±0.66，研究组较对照组明显升高，差异有统计学意义(t=7.943，P<0.05)。

2.2不同特征胃癌患者血清中miR-181b-3p的相对表达水平 不同性别、年龄和肿瘤最大径胃癌患者血清中miR-181b-3p相对表达水平比较，差异无统计学意义(t=0.906、P=0.372，t=0.251、P=0.803，t=0.397、P=0.694)。未/低分化程度、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者血清中miR-181b-3p相对表达水平明显高于中/高分化程度、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者，差异有统计学意义(t=3.509、P<0.001，t=3.080、P=0.004，t=2.641、P=0.013)。见表1。

表1 不同特征胃癌患者血清中miR-181b-3p的相对表达水平

2.3血清miR-181b-3p检测在胃癌中的诊断价值 血清miR-181b-3p诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.886，95%可信区间(95%CI)为0.815～0.956，灵敏度为68.8%，特异度为91.1%，最佳截断值为0.597。见图1。

图1 血清miR-181b-3p诊断胃癌的ROC曲线

2.4miR-181b-3p靶基因的预测 使用数据库miRDB、miRWalk、TargetScan和DIANA TOOLS数据库预测miR-181b-3p的靶基因，预测的个数分别为743、2 061、4 995和1 092个，然后用Veney 2.1.0软件绘制韦恩图，结果显示4个数据库预测靶基因的交集有95个，占各预测软件预测靶基因总和的1.5%。运用Cytoscape_v3.6.1软件，绘制出PPI 网络图，结果表明，miR-181b-3p的靶基因集合编码蛋白质之间的相互作用关系较复杂，有20个编码蛋白质之间的相互作用关系较稳定。见图2、3。

图2 miR-181b-3p靶基因预测的韦恩图

图3 miR-181b-3p预测靶基因所编码蛋白质的PPI网络图

3 讨 论

随着胃癌诊治技术的不断发展，胃癌的治疗效果已经有所提升，但是胃癌患者5年生存率依然很低，主要原因是大多数胃癌患者在晚期时才被诊断，错过了最佳诊治时期。因此，提高胃癌早期诊断率具有重要意义，探索有效的诊断指标是关键环节。

近年来，随着各种高通量测序平台用于分析全基因组miRNA基因的表达，有研究者指出，miRNA的异常表达与肿瘤密切相关，并有望成为新的具有巨大潜力的肿瘤生物标志物[8]。miRNA可通过形成RNA诱导沉默复合体与靶基因miRNA的3′端非编码区互补结合，在转录后水平调控靶基因的翻译和表达[9]。一般情况下，单个miRNA可以调控多个靶基因的表达，既可能调控癌基因，也可能调控抑癌基因，参与肿瘤的发生、发展过程。

多种miRNA在胃癌的发生、发展中发挥重要作用，例如miR-155通过靶向SMAD2、FADD抑制胃癌细胞凋亡[10]；miR-218可通过SLIT/ROBO1信号通路促进胃癌细胞的侵袭和迁移[11]；miR-21通过下调抑癌基因RECK的表达促进胃癌细胞的增殖与侵袭[12]。miR-181家族也是受到众多关注的miRNA之一，目前已知的miR-181家族重要成员有miR-181a、miR-181b-3p、miR-181c和miRNA-181d。在胃癌的相关研究中，安娟等[13]指出胃癌患者血清中的miR-181d相对表达水平明显高于健康对照者，且可能通过PDCD4发挥负向调控作用；谭玲等[14]在细胞水平证实miR-181c可能参与幽门螺杆菌(Hp)相关胃癌的发生、发展；GUO等[15]在细胞水平揭示miR-181b-3p能通过调节TIMP-3的表达，调控胃癌细胞的增殖和侵袭；ZHANG等[16]发现miR-181a能通过调节肿瘤抑制基因KLF6促进胃癌细胞的增殖及转移。

本研究结果表明，与健康志愿者相比，胃癌患者血清中miR-181b-3p呈高表达。同时，通过对胃癌患者特征分析表明，不同性别、年龄、肿瘤最大径患者的miR-181b-3p相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，不同淋巴结转移情况、分化程度和TNM分期患者的miR-181b-3p相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明，miR-181b-3p 可能作为癌基因参与胃癌的发生、发展，这也从临床上进一步验证了miRNA在胃癌发展过程中的作用。为了进一步探讨血清miR-181b-3p检测在胃癌中的诊断效能，本研究绘制ROC曲线确定miR-181b-3p检测的最佳截断值为0.597，表明miR-181b-3p对胃癌具有一定的诊断价值。但是，miR-181b-3p与胃癌的作用机制尚不清楚，本研究通过结合多个靶基因预测数据库对miR-181b-3p进行靶基因预测及相应的蛋白相互作用分析，为后续的作用机制研究提供切入点。邓珊珊等[17]的研究证实细胞基质蛋白3(MATR3)参与调控病毒RNA的核输出、病毒基因组的稳定性和表达。SUN等[18]和SONG等[19]分别指出miR-193a-5p和miR-107通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)加速胃癌的恶化。本研究绘制的PPI网络图显示，MATR3和CDK8均与miR-181b-3p存在相互关系，因此，推测miR-181b-3p可能通过MATR3或CDK8参与胃癌的发生，这一推测尚需要后续研究进一步证实。

综上所述，胃癌患者血清miR-181b-3p相对表达水平与胃癌有密切联系，对胃癌的诊断和机制研究具有重要意义。