miR-146a-3p在胃癌患者血清中的表达及临床意义

王宗艳，刘 倩

陕西省人民医院消化内二科，陕西西安 710068

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第二大原因[1]。胃癌在中国的发病率和病死率均较高，每年新增病例约40万例，死亡约30万例[2]。近年来，虽然外科手术设备和辅助治疗方法取得了显著的发展，但由于胃癌患者发现时多为中晚期，手术后复发率较高，且总体5年生存率仍不高，低于30%，预后较差[3]。进一步识别胃癌预后的危险因素，探索新的药物治疗靶点，对于控制胃癌发生和复发至关重要。microRNAs(miRNAs)是一类进化保守的非编码RNA，通过与靶向mRNA的互补位点结合，抑制翻译进程，在转录水平负调控基因表达[4]。miRNAs在癌症中异常表达，可作为癌症诊断和判断预后的指标[5]。陆玉等[6]发现miR-146a-3p在多种胃癌细胞中表达下调，具有较高的预测患者预后价值。本研究探讨miR-146a-3p在胃癌患者血清中的水平及其对预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2015年3月至2017年9月收治的64例胃癌患者作为胃癌组，男37例，女27例；年龄22～79岁，平均(53.38±8.47)岁；肿瘤淋巴结转移(TNM)分期Ⅰ期9例，Ⅱ期18例，Ⅲ期19例，Ⅳ期18例；低分化38例，中分化15例，高分化11例。纳入标准：(1)所有患者均符合胃癌临床诊断标准[7]；(2)经胃镜和病理学检查证实为胃癌；(3)首次确诊；(4)病灶无坏死；(5)患者自愿签署该项研究的知情同意书。排除标准：(1)合并其他消化系统恶性肿瘤；(2)合并血液病、免疫系统疾病、结缔组织疾病；(3)合并原发性肝肾损伤；(4)有3个月内手术史，或急慢性感染；(5)合并心肌梗死、心脏病。另选取同期本院体检健康者28例作为健康组，男15例，女13例；年龄24～80岁，平均(52.96±8.54)岁。本研究获得本院医学伦理委员会批准后进行。

1.2方法

1.2.1临床资料的收集 收集所有研究对象的性别、年龄信息，患者的TNM分期、肿瘤最大径、局部浸润深度、淋巴结转移情况、分化程度等资料。

1.2.2血液标本的采集 患者入院后，于次日清晨采集空腹静脉血约8 mL，健康组于体检时采集静脉血，置于无抗凝剂的采血管中。3 000 r/min离心15 min。收集上层血清，分装至两支离心管中，—20 ℃条件下保存备用。

1.2.3血清miR-146a-3p的检测 取1份血清标本，加入1 mL TRIzol提取剂，提取总RNA，并进行检测。按照反转录试剂盒(美国Thermo公司产品)说明书将RNA反转录为cDNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清中miR-146a-3p水平。miR-146a-3p上游引物：5′-GCGCGACCTGTGAAGTTCAG-3′；下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。以U6为内参，U6上游引物：5′-CTCGCATCGCGTAAGGCACA-3′；下游引物：5′-AACGCTACTCGAATTAGCGT-3′(引物由上海金唯智生物科技有限公司合成)。严格依据qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，配制反应物体系。设置qRT-PCR仪器(美国MJ Research公司产品)程序：96 ℃预变性5 min，96 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸，进行35个循环，上机进行PCR扩增。2—ΔΔCt法对miR-146a-3p进行定量。

1.2.4生化指标检测 取另外1份血清标本，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中糖类抗原72-4(CA72-4)水平。严格按照人CA72-4 ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司产品)说明书进行操作，采用酶标仪(美国Thermo公司产品)检测标本在450 nm处吸光度值(A)，制作标准曲线，计算CA72-4水平。

1.2.5随访 通过电话方式对患者进行随访，每半年进行1次随访，随访终点为患者发生胃癌相关死亡。随访截止时间为2020年10月1日。根据3年内，患者预后情况，将患者分为存活组(n=14)和死亡组(n=50)。

1.3观察指标 (1)比较胃癌组和健康组血清中miR-146a-3p、CA72-4水平；(2)分析胃癌组患者miR-146a-3p、CA72-4水平与性别、年龄、临床资料的关系；(3)分析胃癌组血清miR-146a-3p水平与CA72-4水平之间的相关性；(4)比较存活组和死亡组miR-146a-3p、CA72-4水平；(5)分析胃癌组血清miR-146a-3p、CA72-4水平对胃癌患者预后的预测价值。

2 结 果

2.1健康组与胃癌组血清miR-146a-3p、CA72-4水平比较 胃癌组血清miR-146a-3p水平低于健康组，血清CA72-4水平高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 健康组与胃癌组血清中miR-146a-3p、CA72-4水平比较

2.2不同特征胃癌患者血清miR-146a-3p、CA72-4水平比较 不同TNM分期、淋巴结转移情况、局部浸润深度、肿瘤最大径、分化程度胃癌患者的血清miR-146a-3p、CA72-4水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同性别、年龄、病理类型胃癌患者血清miR-146a-3p、CA72-4水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同特征胃癌患者血清miR-146a-3p、CA72-4水平比较

2.3胃癌患者血清miR-146a-3p水平与CA72-4水平的相关分析 Pearson相关分析结果显示，胃癌患者血清miR-146a-3p水平与CA72-4水平呈负相关(r=—0.474，P<0.001)。

2.4存活组和死亡组miR-146a-3p、CA72-4水平比较 死亡组血清miR-146a-3p水平低于存活组，血清CA72-4水平高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 存活组和死亡组血清miR-146a-3p、CA72-4水平比较

2.5血清miR-146a-3p、CA72-4水平对胃癌患者预后的预测价值 血清miR-146a-3p、CA72-4预测胃癌患者预后的AUC分别为0.864(0.764～0.963)、0.769(0.652～0.885)；血清miR-146a-3p的AUC大于血清CA72-4，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表4。

表4 血清miR-146a-3p、CA72-4水平对胃癌患者预后的预测价值

图1 血清miR-146a-3p、CA72-4水平对胃癌患者预后的预测价值的ROC曲线

3 讨 论

miRNAs与靶基因的3′非翻译区不完全结合，通过诱导翻译沉默或mRNA降解负调控多个基因的表达[8]。超过50%的miRNAs基因位于癌症相关基因组区域或染色体的脆性位点，是人类癌症发病的重要因素[9]。miR-146a在前列腺癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症中发挥肿瘤抑制因子作用，参与肿瘤细胞增殖、分化和凋亡。在高转移性乳腺癌细胞株中，miR-146a表达下调，外源性过表达miR-146a削弱细胞的侵袭、迁移能力[10]。miR-146a-3p是miR-146a家族成员之一，研究表明，miR-146a-3p在胃癌中低表达，且与患者预后存在较强的相关性，可能成为预测胃癌预后的生物标志物[11]。在乳腺癌组织和细胞中过表达miR-146a-3p通过靶向垂体肿瘤转化基因(PTTG1)抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭、增殖，从而抑制乳腺癌的进展[12]。

本研究结果显示，胃癌组血清miR-146a-3p水平低于健康组，表明胃癌的发生和发展可能与miR-146a-3p的表达量降低，相关靶基因水平升高相关。大量研究表明，TNM分期、淋巴结转移、局部浸润深度、肿瘤最大径、分化程度是影响胃癌患者临床结局的重要因素[13-14]。由于胃癌在分子水平上存在异质性，仅依靠TNM分期等指标预测胃癌患者的预后准确性欠佳，因此，在TNM分期、肿瘤最大径等基础上，寻找预测胃癌患者预后的分子标志物，有助于制订合理的治疗方案，可能提高患者生存率。本研究发现，不同TNM分期、淋巴结转移情况、局部浸润深度、肿瘤最大径、分化程度胃癌患者的miR-146a-3p水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且死亡组血清miR-146a-3p水平低于存活组，表明血清miR-146a-3p低表达可能与胃癌患者预后不良有关。CA72-4是一种相对分子质量较高的黏蛋白类抗原，其水平与肿瘤最大径、TNM分期、淋巴结转移情况有关，是妇科相关癌症和消化系统常见肿瘤的标志物[15]。雷振宇[16]报道，胃癌患者血清CA72-4水平与肿瘤恶性程度呈正相关，并且其高表达预示患者预后不良，临床上常采用CA72-4联合其他指标预测患者临床结局。本研究通过ROC曲线分析血清miR-146a-3p对胃癌患者预后的预测价值，结果发现当血清miR-146a-3p<0.88时，灵敏度和特异度分别为94.0%和71.4%，AUC为0.864，明显高于CA72-4的AUC(0.769)，表明血清miR-146a-3p水平对胃癌患者预后的预测价值较高，具有较高的灵敏度和特异度，血清miR-146a-3p可作为预测胃癌患者预后的潜在标志物。

综上所述，血清miR-146a-3p水平在胃癌患者中下调，可作为评估胃癌患者预后的标志物，特异度和灵敏度较高。