基层医院应用GeneXpert MTB/RIF检测诊断早期肺结核的价值分析

田海兵，卢大儒

1.上海市奉贤区古华医院检验科，上海 201400；2.复旦大学生命科学学院，上海 200438

在全球范围内，结核病是由结核分枝杆菌(MTB)为单一传染源引起的慢性传染性疾病[1]。根据世界卫生组织(WHO)发布的报告，2018年全球约有1 000万人患有结核病，约有150万人死于结核相关性疾病[2]。我国是结核病高负担国家，我国结核病患者约占全球结核病总人数的9.7%，2017年我国结核病发病人数和死亡人数分别约为83.1万和3.93万[3]。因此，早期诊断和规范化治疗是降低结核病发病率和病死率的关键所在。基层医院在结核病的早期诊断、管理、传报和转诊方面起关键性作用。然而，基层医院在面对疑似结核病患者时，往往缺乏准确、快速、特异度高的诊断方法，容易漏诊[4]。因此，快速、准确的诊断技术对于结核病的早期诊断和治疗非常重要。MTB/利福平耐药实时荧光定量基因扩增检测系统(GeneXpertMTB/RIF，以下简称为Xpert系统)作为新的分子诊断技术已被广泛应用于临床，该技术使用5种分子信标，涵盖了细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因(rpoB基因)81 bp利福平(RIF)耐药核心区(RRDR)，完成一份标本检测仅需2 h。Xpert系统不仅能够快速检测标本中的MTB，而且能够检测rpoB基因是否存在突变，判断MTB对RIF的耐药性[5-6]。本研究分析了Xpert系统在基层医院应用情况，以评价该技术对结核病诊断的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年1-9月上海市奉贤区古华医院结核病专科门诊就诊的288例疑似肺结核患者作为研究对象，其中男154例，女134例；年龄13～82岁，平均(47.5±19.3)岁。纳入标准：胸部影像学检查符合肺结核影像学表现，或具有肺结核可疑症状(咳嗽≥2周或咯血、发热、体质量减轻>3 kg)及有结核患者密切接触史。排除标准：(1)接受过抗结核治疗；(2)存在其他呼吸道感染。

1.2仪器与试剂 美国赛沛公司的Xpert系统及其配套试剂；美国BD公司的BACTEC MGIT320全自动分枝杆菌快速培养系统(以下简称MGIT320)及配套试剂；MPT64MTB抗原检测试剂盒购自美艾利尔(中国)医疗器械有限公司；Ziehl-Neelsen抗酸染色液、L-J固体培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 用洁净的痰瓶收集所有研究对象清晨第一口痰，每例患者收集3份标本，每份标本2 mL痰液，收集后立即送检，2～8 ℃保存，并在3 d内完成检测。

1.3.2痰涂片抗酸染色镜检(AFB) 按《中国结核病防治规划 痰涂片镜检质量保证手册》[7]，取无菌棉签搅拌痰液使其充分混匀，每份标本涂3张玻片，干燥后进行痰涂片AFB。镜下未见抗酸杆菌判断为阴性，见抗酸杆菌判断为阳性，并根据抗酸菌量多少判为4+、3+、2+、1+、≤9条/300个高倍视野。

1.3.3MTB培养及药敏试验 液体培养：取1份痰液标本用N-乙酰基L-半胱氨酸(NALC)NaOH消化液进行消化，去污染，接种于MGIT320培养管中。仪器出现阳性报警后取出，经AFB后证实为抗酸菌，同时用MPT64抗原检测，并记录出现阳性的天数。药敏试验：对所培养的阳性菌鉴定后如为MTB，采用MGIT320配套的药敏试剂盒，按说明书进行药敏试验，并记录结果。

1.3.4Xpert系统检测 将痰液标本用含有异丙醇和NaOH的标本处理液(SR)消化处理，痰液和处理液的比例为1∶2，旋涡振荡20 s，室温静置15 min，用配套的滴管取2 mL消化液装入反应盒中，将反应盒装载入仪器，全自动仪器完成提取和扩增。MTB数量按MTB-DNA拷贝数高低分为高、中、低、极低、未检出5个量级，RIF耐药性检测结果为敏感或者耐药。

1.3.5质量控制 上海市奉贤区古华医院检验科参加上海市疾病预防控制中心结核实验室每年两次MTB涂片镜检、药敏试验和MTB分子诊断技术能力验证工作，成绩合格；本研究中的相关操作由两名经验丰富的检验人员同时操作，确保检测质量。

2 结 果

2.1剔除研究对象情况 在疑似肺结核患者中，排除2例培养后AFB判断为污染标本的患者，5例患者标本MGIT320培养后经AFB见抗酸杆菌，但MPT64 MTB抗原检测结果为阴性，判断可能为非结核分枝杆菌(NTM)，或存在MPT64蛋白编码区变异，最终281例疑似肺结核患者纳入数据统计。

2.2痰涂片AFB、MGIT320培养、Xpert系统检测阳性率比较 281例疑似肺结核患者中，痰涂片AFB阳性为44例，阳性率为15.7%；MGIT320培养阳性74例，阳性率为26.3%；Xpert系统检测阳性为80例，阳性率为28.5%。Xpert系统检测和痰涂片AFB，以及痰涂片AFB和MGIT320培养的阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=13.41、9.65，P<0.05)。而Xpert系统检测与MGIT320培养的阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.322，P>0.05)。

2.3痰涂片AFB、Xpert系统的检测性能比较 以MGIT320培养为金标准，根据Xpert系统、痰涂片AFB检测结果计算灵敏度、特异度、PPV、NPV。Xpert系统检测的灵敏度为90.5%(67/74),特异度为93.7%(194/207)。痰涂片AFB检测的灵敏度为51.4%(38/74)，特异度为97.1%(201/207)。痰涂片AFB与Xpert系统检测的灵敏度、NPV、一致性比较，差异有统计学意义(χ2=25.57、16.84和15.42，P<0.05)，而特异度、PPV比较，差异无统计学意义(χ2=2.70、0.149，P>0.05)。见表1、2。

表1 痰涂片AFB、MGIT320培养、Xpert系统检测结果比较(n)

表2 痰涂片AFB与Xpert系统检测性能比较[%(95%CI)]

Xpert系统检测与MGIT320培养之间的一致性为92.9%，Kappa值为0.85，具有高度的一致性。不一致性方面，13例Xpert系统检测为阳性标本，但MGIT320培养为阴性，在这13例中，AFB有5例为阳性，并有10例疑似肺结核患者临床诊断为肺结核并接受了抗结核治疗症状得到改善，3例为陈旧性病灶，显示出Xpert系统具有较强的检测能力。

2.4Xpert系统检测与痰涂片AFB量级的比较 281例疑似肺结核患者标本中，经Xpert系统检测评定为高、中、低、极低、未检出5个等级的例数分别为9、27、21、23、201例，经AFB评定为4+、3+、2+、1+、≤9条/HP和阴性的例数分别为5、2、14、17、12、230例。见表3。

表3 Xpert系统与痰涂片AFB各等级量级的比较(n)

2.5Xpert系统检测与MGIT320培养+药敏分析结果比较 在281例疑似患者中，Xpert系统检测阳性为80例，其中5例检测为RIF耐药。MGIT320培养阳性为74例，药敏分析结果显示RIF耐药为6例。见表4。

表4 Xpert系统检测与MGIT320培养+药敏分析结果比较(n)

2.63种方法阳性检出时间比较 Xpert系统检测阳性结果报告时间为2 h；痰涂片AFB报出阳性结果平均耗时为4 h(包括涂片、干燥、染色、镜检过程)；MGIT320培养阳性报告时间为(12.0±5.5)d；培养42 d无MTB生长则报告为阴性。培养后药敏分析还需要(8.2±4.3)d。

3 讨 论

2010年，WHO认可并推广Xpert系统在全球结核病高发国家使用[8]。与MGIT320培养比较，Xpert系统操作简单，对实验室环境要求比较低，人员简单培训即可上岗操作，检测时间为2 h，被视作第一个MTB检测的即时检验技术(POCT)，基层医院及社区卫生中心也可开展[9-10]。

本研究结果显示，在281例疑似肺结核患者中，痰涂片AFB阳性44例，阳性率为15.7%；MGIT320培养阳性74例，阳性率为26.3%；Xpert系统检测阳性80例，阳性率为28.5%。Xpert系统检测阳性率明显高于痰涂片AFB和MGIT320培养。以MGIT320培养为金标准，Xpert系统检测的灵敏度为90.5%，特异度为93.7%；痰涂片AFB检测的灵敏度为51.4%，特异度为97.1%，这与国内外多篇研究结果相似[11-14]，显示出Xpert系统对肺结核诊断具有较高的灵敏度和特异度。痰涂片AFB和MGIT320培养阳性率较Xpert系统检测阳性率低的原因主要是方法学的局限性，每毫升标本需要5×103～1×104个细菌才能检出，而Xpert系统每毫升痰标本仅需131个细菌就能检出[5,12]。当Xpert系统检测等级越低，AFB出现阴性的概率越大。而MGIT320培养只能检出活菌，前处理时，4%NaOH液化痰液的同时可能会杀死MTB，导致培养失败。而且，MGIT320培养并不能区分MTB还是NTM，通过MPT64 MTB抗原检测培养阳性菌，有5例MPT64 MTB抗原检测为阴性，Xpert系统检测皆为阴性，说明Xpert系统对区分NTM有较高的参考价值。Xpert系统检测的局限性主要是不能区分死菌还是活菌。

RIF耐药性是耐多药性结核病(MDR-TB)的关键指标，95%的RIF耐药突变发生在rpoB基因81 bp RRDR。Xpert系统的5个探针覆盖该突变区，从而能够快速检测出耐药信息[15]。MGIT320培养+药敏分析检测出6例耐药，而Xpert系统检测出5例耐药，具有高度的一致性，大样本数据比较也得到证实[16]。不一致的原因可能是非rpoB基因突变导致，尚需加大样本量测序方法予以确认突变类型。从检测时间上看，Xpert系统检测只需要2 h即可检测出RIF耐药性，而MGIT320培养+药敏分析总共需要约20.5 d，显示出Xpert系统具有较大的优势。

综上所述，Xpert系统在结核病检测方面具有操作简单、检测时间短、灵敏度、特异度高等优势，不但能够准确检出含菌量低的标本，对NTM感染也有较高的参考价值，同时还能检测出RIF耐药的情况。因此，Xpert系统检测系统非常适合在基层医院开展，在结核病的早期诊断、转诊、治疗方面具有重要价值。