白细胞介素-6量子点荧光免疫层析法的建立及性能验证*

唐劲松，林景涛，周正维，任燕飞，张二盈

1.广东省东莞市大朗医院检验科，广东东莞 523700；2.深圳市金准生物工程有限公司，广东深圳 510103

白细胞介素(IL)-6作为一种炎症因子，当机体发生感染时迅速升高，可在2 h达高峰，其升高水平与感染的严重程度一致，并诱导降钙素原(PCT)和C反应蛋白(CRP)分别在感染2 h和6 h后开始升高，而且IL-6与患者预后密切相关[1]。IL-6即时检验(POCT) 已经开始用于临床，且应用潜力较大。目前，有多种IL-6的检测方法[2]，较为常用的是化学发光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法及免疫层析法，不同的检测方法各有优劣。量子点荧光材料是一种新型标记材料，已经开始应用于临床，与普通荧光材料相比，量子点荧光材料具有荧光强度高、光稳定性好、荧光寿命长、激发谱宽、发射谱窄、宽大的斯托克斯位移和生物相容性好等优点[3]。本研究通过量子点荧光材料标记抗体，研发出量子点免疫荧光层析法IL-6检测试剂盒，从灵敏度、回收率、精密度、特异度等方面进行性能验证，并与贝克曼化学发光法IL-6检测试剂盒进行对比。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 量子点荧光免疫分析仪KF-Q001-A由深圳市金准生物工程有限公司生产，其他主要仪器包括YXQ-LS-50A型立式压力蒸汽灭菌器(杭州科晓化工仪器设备有限公司)、SW-CJ-2FD型超净工作台(上海巴玖实业有限公司)、三维划膜喷金仪(上海金标生物有限公司)、DXI800化学发光仪(美国贝克曼公司)。量子点CdSe/ZnS、巯基丁二酸(MES)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺 (EDC)、巯基甘醇单甲醚、小牛血清购于Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；IL-6抗体购于芬兰MEDIX公司；IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、干扰素-γ (INF-γ)购于英国Abcam公司；试纸条材料购于上海杰一生物技术有限公司；IL-6化学发光检测试剂盒购于美国贝克曼公司。

1.2方法 (1)水溶性量子点的制备：取油溶性量子点CdSe/ZnS溶解在正己烷中，制得油溶性量子点溶液，在巯基甘醇单甲醚溶液中加入油溶性量子点溶液，得到水溶性量子点。(2)量子点的偶联：取30 μL量子点，加入一定量的抗IL-6鼠抗人单克隆抗体Ⅰ，室温孵育3 h，12 800 r/min离心20 min，弃上清，加入5%牛血清清蛋白封闭液封闭。(3)IL-6试剂盒的制备：①取10 μL耦联有抗体的量子点，在处理好的聚酯纤维膜上喷涂，固定在结合垫上，用于检测抗原。②采用双抗夹心法原理，将IL-6鼠抗人单克隆抗体Ⅱ包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线(T线)，兔抗鼠 IgG，可以直接和量子点标记的单克隆抗体Ⅰ结合，在NC膜上形成质控线(C线)。③将样品垫、结合垫、NC膜、滤纸依次粘贴在底板上，裁剪干燥的试纸条，制得检测试剂盒。

1.3标准曲线的绘制 使用浓度分别为0、10、50、120、250、400、800、1 600、3 000、4 000 pg/mL的标准品，每个浓度做10个平行测试，以测试线荧光信号T与质控线荧光信号C的比值(T/C)为Y轴，样品浓度值为X轴，进行拟合计算方程，得到标准曲线并储存在SD芯片中。检测标本时，通过SD芯片将标准曲线导入仪器，待标本和检测卡反应结束后，仪器进行检测读出光电信号值，将光电信号值代入标准曲线中，即可计算出该标本的浓度值。

1.4性能验证

1.4.1灵敏度试验 将 IL-6浓度为50 pg/mL的标准品用IL-6阴性小牛血清稀释为20、10、5、4、3、2、1 pg/mL，取100 μL加入试剂卡，然后进行检测，当仪器检测不出荧光值时确定该方法的最低检出量。

1.4.2回收试验 本试验取一定量的IL-6标准品添加到阴性小牛血清中，使血清中IL-6终浓度分别为50、2 500、5 000 pg/mL。用试剂卡进行检测，每个浓度点重复检测6次。根据测得的荧光定量信号T/C，按准曲线反求出待测标本的浓度。计算出IL-6反求浓度，IL-6添加浓度比值的百分率即为回收率。回收率越接近100%，说明试剂卡检测越准确。

1.4.3精密度试验 本试验用同一批检测试剂盒检测板内的精密度，再选用5板不同批次的试剂盒进行不同批次间的板间精密度试验。对浓度为0、50、250、800、4 000 pg/mL的IL-6标准品进行检测，用试剂卡进行测试，每份标本重复测定10次。计算出每个浓度点的变异系数(CV)，对批内精密度和批间精密度进行分析。

1.4.4特异度试验 取血清中IL-6常见竞争物IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、INF-γ进行检测，浓度均为1 000 pg/mL，每种物质重复进行6次检测。计算抗体交叉反应方法为Abraham法，计算公式如下：交叉反应率(%)=(S/Z)×100%，S表示抗原类似物用试剂卡检测的浓度，Z表示抗原类似物添加的浓度。

1.4.5稳定性试验 试剂盒中的检测试剂卡通常保存在室温干燥阴凉的环境中。参照体外诊断胶体金试纸条的稳定性考察方法，通常试剂卡在 50 ℃烘箱中放置1个月进行加速破坏稳定性测试，相当于检测卡常温下保存1年的有效性。本研究将试剂卡在50 ℃烘箱中分别放置1、2、3、4周后取出放入干燥房内，与干燥房内常温放置的试剂卡进行对比，检测试剂卡的稳定性。

1.4.6相关性试验 选取广东省东莞市大朗医院临床标本200份，浓度为0.00～580.42 ng/mL，分别用本研究自制试剂盒和贝克曼化学发光检测试剂盒2 h内完成检测，通过线性回归分析得出斜率a，截距b，决定系数(R2)。

2 结 果

2.1标准曲线 浓度为0、10、50、120、250、400、800、1 600、3 000、4 000 pg/mL的IL-6标准品的测试结果T/C分别为0.83、0.86、0.91、1.16、1.57、2.02、2.59、3.86、5.13、5.82，通过拟合软件计算，标准曲线方程Y=0.001 3X+1.164 8,R2=0.958 7，两者线性关系良好，见图1。样品浓度在10 pg/mL时，荧光信号趋近于0，样品浓度在4 500 pg/mL时，T/C为6.324 8，不再满足该线性方程，自制试剂盒的线性检测范围为10～4 000 pg/mL。

图1 IL-6标准曲线

2.2灵敏度 当IL-6浓度分别为20、10、5、4、3 pg/mL时，荧光值分别为206、154、106、43、11，荧光值随着IL-6浓度降低而降低，当样品浓度为2 pg/mL时，仪器检测不出荧光值，自制试剂盒的最低检出限为2 pg/mL。

2.3回收试验结果 在50、2 500、5 000 pg/mL浓度点包含低、中、高的浓度范围内进行添加回收试验，在50 pg/mL浓度的平均回收率为95.68%，CV为 8.57%，在2 500 pg/mL浓度的平均回收率为101.23%，CV为6.99%，在5 000 pg/mL浓度的平均回收率为104.45%，CV为4.76%。

2.4精密度检测结果 分别用同一批次和5个批次IL-6荧光定量免疫层析试剂卡检测 0、50、250、800、4 000 pg/mL 5个浓度点的血清，每个浓度检测10次。同一批次内板内各浓度点T/C的CV范围为2.21%～3.93%。5批次混合后测得的板间各浓度点T/C的CV为2.42%～5.36%。同一批次的板内和5个批次板间的CV均小于15%。

2.5特异度检测结果 对待测浓度为10 000 ng/mL的竞争物IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、INF-γ进行检测，结果表明竞争物IL-4、INF-γ在试验中并未检测到；IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-8的交叉反应率均小于0.1%，见表1，试剂盒与这些竞争物的交叉反应率低，表明特异度良好。

表1 试剂盒交叉反应测试结果

2.6试剂卡稳定性试验结果 荧光定量免疫层析试剂卡的稳定性试验结果见表2，试剂卡放在 50 ℃烘箱中加速破坏1、2、3、4周，在标准品测试的情况下的反应曲线与常温保存的试剂卡基本吻合，低、中、高浓度的荧光信号T/C基本没变化。

表2 试剂卡稳定性试验结果

2.7相关性试验结果 自制试剂盒检测的200份血清标本结果与贝克曼化学发光检测试剂盒检测值相近，对在0～600 pg/mL范围内的高、中、低浓度临床标本进行回归分析，回归方程为Y=0.989 4X+2.998 5，R2=0.997 1，见图2。R2>0.95，两种测试方法测试值相关性良好。

图2 荧光定量免疫层析法与化学发光法检测IL-6的相关性分析

3 讨 论

IL-6在体内的作用比较广泛，对免疫炎性反应、肝脏急性蛋白合成、造血功能、骨代谢都有调节作用。有研究证明，IL-6是确定全身炎症反应综合征患者疾病严重程度最重要的细胞因子[4]。大量研究证明，IL-6参与新型冠状病毒肺炎的“细胞因子炎症风暴”，可加重病情恶化[5-6]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》将IL-6作为病情恶化的炎性反应指标，本课题组有研究证明新型冠状病毒肺炎不同类型患者体内IL-6比较，差异有统计学意义(P<0.05)[7]。快速、特异地检测血液中IL-6对多种疾病的早期诊断、治疗及预后有很好的作用。研究一种灵敏度高、特异度高、检测速度快、操作简单的 IL-6定量检测试剂盒具有广阔的应用前景[8-9]。IL-6化学发光检测试剂盒主要由罗氏和贝克曼等公司生产，此类产品检测需大型仪器，试剂价格昂贵、检测时间较长，且需要专业人员操作，国内一些生产企业也进行了相关产品的开发，但技术上以ELISA法为主，灵敏度及特异度较高，但存在操作烦琐、检测时间长等问题[10-11]。本研究通过量子点标志荧光抗体，建立得到 IL-6的量子点荧光免疫层析法，自制试剂盒线性范围较宽，灵敏度高，达到pg/mL级别。张文琪[12]研究显示，胶体金定量法检测IL-6的检测限为 8.494 pg/mL，试剂盒的检测范围为25.278～848.000 pg/mL，可见，无论是灵敏度还是检测范围，量子点IL-6试剂盒都优于胶体金定量法。本研究结果显示，自制试剂盒的准确性、精密度、特异度及稳定性都较好。本研究自制试剂盒与贝克曼化学发光检测试剂盒同时进行200份临床标本检测并进行比对，结果基本一致，表明这两种测试方法测试值相关性良好。本研究自制试剂盒所用的主要试剂均为国产和自制所得，生产成本低，未来在市场上的售价也将低于其他诊断试剂，且荧光检测仪器便携，在患者身旁18 min内即可完成检测，而且建立的方法比市场上的ELISA试剂盒更方便、快捷，操作人员不需要太多的专业技能，比市场上胶体金免疫层析法试剂盒更灵敏，检测范围更广，稳定性更好。表明本研究建立的IL-6荧光免疫层析法的初步应用比较成功，临床推广应用将具有广阔的空间。但考虑到检测的临床标本相对数量较少，下一步将与化学发光检测试剂盒进行大量血清标本比对试验，将对自制试剂盒灵敏度、特异度，及其与其他化学发光检测试剂盒的一致性和符合率进行进一步研究。量子点荧光免疫层析法IL-6试剂盒的开发旨在为临床上检测IL-6提供更加简便、快捷的检测方法，对IL-6的早期诊断及临床检验具有重要价值。