小麦生理型雄性不育系花药内源JA与ABA含量动态变化及其代谢通路差异基因表达研究

魏霁桐，吴国丽，李慧敏，郭佳林，宋齐鲁，张亚敏，牛 娜，王军卫，马守才，张改生，朱 峰，宋瑜龙

(1.西北农林科技大学农学院/国家杨凌农业生物技术育种中心/国家小麦改良中心杨凌分中心/小麦育种教育部工程研究中心/陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室，陕西杨凌 712100；2.周至县农业农村局，陕西周至 710400)

小麦作为我国第三大主要粮食作物，其籽粒含有丰富的淀粉和蛋白质，对维持人类生命活动、保障身体健康和推动社会经济可持续发展起到了至关重要的作用，培育并大面积推广高产、优质、广适型小麦新品种仍是当前小麦育种工作的重点[1]。小麦产量、品质、抗逆性等性状均属于质量-数量性状，受主效基因和微效基因共同调控，对于这些复杂的多基因控制的数量性状来说，传统的杂交育种方法很难将所有有利基因聚合到1个基因型后代中，因此加快小麦高配合力优异种质资源创新，配制杂交种，免去后代分离与选择，实现多基因高效聚合，可能是推动高产、优质、广适小麦新品种选育进程、突破现阶段育种瓶颈问题的有效途径[2]。目前，小麦杂种优势利用主要有三系途径(不育系、保持系及恢复系)、光温敏两系途径及化学杂交剂途径[3]。其中，三系途径主要存在不育基因转换耗时、保持系与不育系制种分离费工、恢复源狭窄等问题[4]；光温敏途径同样存在光温敏基因转换耗时、花粉育性转换临界温度受环境因素影响较大、育性不稳定等问题[5]，这两类杂种优势利用途径一定程度限制了杂交组合的组配范围，限制了强优势杂交组合出现几率，不利于杂交小麦新组合的鉴选及规模化生产和大面积应用。与三系途径和光温敏两系途径相比，化学杂交剂途径不受小麦基因型限制，可以直接诱导任意常规优良品种(系)花粉败育，作为母本大量组配杂交组合，具有亲本选择范围广、强优势组合出现几率高、更换组合速度快等优点[6]。因此，利用化学杂交剂诱导小麦花粉败育，产生生理型雄性不育系，配制小麦杂交种可能是实现小麦杂种优势利用的最有效途径之一。

化学杂交剂(chemical hybridizing agent，简称CHA)是用于诱导植物花粉败育，但不伤及雌蕊和影响植物生长发育的一类化学药剂[7]。SQ-1是我国自主研发的、具有自主知识产权的一类新型高效哒嗪类小麦化学杂交剂，具有杀雄窗口期长、不受母本基因型限制等特点，且诱导花粉败育率在95%以上，不伤雌蕊，异交结实率稳定在85%以上，对推动杂交小麦进入生产、实现产业化发展具有重要作用[8]。前人在SQ-1诱导小麦花粉败育机理方面做了大量研究，如：董 剑等[9]利用基因芯片技术对SQ-1诱导的雄性不育及其对照可育系花药进行了分析，结果在两类材料中共发现2 052个差异表达基因，其中上调表达基因 1 294个，下调表达基因758个，通路分析表明，上述基因主要参与植物对逆境的响应、多糖代谢和信号传导等代谢途径；李亚鑫等[10]对SQ-1诱导的不育系及其对照可育系花药中交替氧化酶(AOX1)基因表达模式进行了分析，发现与对照可育系相比，AOX1a在花药单核期表达量最高，二核期表达量减少，但三核期略有上升，推测AOX1a的异常表达可能影响了花药中的抗氰呼吸途径，导致抗氰呼吸紊乱，最终引发花粉败育；朱启迪等[11]利用转录组学技术对SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育及其对照可育系单核期花药进行分析，发现与对照可育系相比，不育系中有 1 088个基因表达模式发生变化，通路分析表明，上述基因共涉及氨基酸代谢、核糖体组分、光合作用及氨基酸代谢、RNA转运及信号转导、活性氧代谢等60个代谢通路。此外，又有学者从蛋白质水平、DNA甲基化水平、泛素化修饰水平、代谢组学水平、生理生化代谢水平及细胞学水平对SQ-1诱导的花粉败育机理进行了系统深入研究，但其分子机理仍未解析清楚[12]。目前在小麦、百合、芝麻等作物上研究表明，植物内源激素在雄蕊发育及育性决定中起着重要作用[13-15]，而有关植物内源激素与SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育花粉败育之间的内在关系尚未见报道。

因此，本研究拟以化学杂交剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育系及其对照可育系的5个发育时期花药为材料，研究不育系和可育系转录水平基因差异及内源JA与ABA含量的变化，以期揭示小麦生理型雄性不育与内源JA与ABA的关系，为在激素水平解析SQ-1诱导花粉败育的生理机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

供试小麦品种西农1376及化学杂交剂SQ-1均由西北农林科技大学农学院张改生教授课题组提供。

西农1376于2018年10月种植于西北农林科技大学农作一站。翌年三月，待西农1376发育至Feeke’s 8.5时期(旗叶抽出至倒二叶一半)，将材料分为两组，一组用5 kg·hm-2的化学杂交剂SQ-1叶面均匀喷施，诱导雄性不育系，记为PHYMS-1376；另一组用等量清水喷施，作为对照可育系，记为CK-1376，其他管理同大田。待PHYMS-1376及CK-1376发育至四分体、单核早期、单核晚期、二核期和三核期时，依据表型分别采集对应时期长势一致的穗子放入冰盒，迅速带回实验室，置于冰上，迅速剥取位于穗中部花药置于干净的载玻片上，滴加1.5%醋酸洋红染色，光学显微镜下观察，确定发育时期。随后，冰上收集PHYMS-1376和CK-1376 两个材料5个发育时期的花药分别放入1.5 mL无酶离心管中，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存、备用。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取及转录组测序

利用Trizol试剂分别提取PHYMS-1376和CK-1376 四分体、单核早期、单核晚期、二核期、三核期花药RNA，随后分别用NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100检测其浓度和质量，并对其进行逆转录，合成第一链和第二链cDNA，并进行纯化，加接头，用Agilent Bioanalyzer 2100系统进行质量评估，随后构建cDNA文库，委托百迈克生物科技有限公司利用IlluminaHiseqXten平台测序，设置3次生物学重复。

1.2.2 序列对比与差异基因表达分析

对原始Reads进行过滤，去除低质量的Reads，得到Clean Reads，并利用Tophat2软件将其与指定的参考基因组进行比对，得到Mapped Data，并基于Nr(NCBI non-redundant protein sequences)、Nt(NCBI non-redundant nucleotide sequences)、Pfam(protein family)、KOG/COG(clusters of orthologous groups of proteins)和Swiss-Prot(a manually annotated and reviewed protein sequence database)数据库对其进行功能注释。按照每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments标准完成基因定量，差异表达基因鉴定依赖于DESeq R 包(1.10.1)，筛选标准为 |log2(fold change)|≥1且FDR<0.05，P-value< 0.05。此外，基于Gene Ontology(GO)数据库(http://geneontology.org)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库(https://www.genome. jp/kegg/pathway.html)，分别利用GO seqR包和KOBAS 软件对差异表达基因进行GO富集和KEGG 通路分析。使用GSEA(WWW.gsea-msigdb.org)的方法对JA及ABA信号通路基因进行富集分析。

1.2.3 ABA含量的测定

分别取PHYMS-1376和CK-1376 四分体、单核早期、单核晚期、二核期、三核期花药约 0.1 g，放入液氮预冷的研钵中磨碎，加入1 mL预冷的甲醇∶水∶乙酸(80∶20∶1)混合液，4 ℃浸提过夜；次日，8 000 r·min-1离心10 min，取上清液4 ℃保存，残渣用甲醇∶水∶乙酸 (80∶20∶1)混合液0.5 mL浸提2 h，8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，并将2次上清液混合，40 ℃条件下，氮气吹干。依次加入0.5 mL石油醚萃取脱色3次，弃去上层醚相，用饱和柠檬酸将下层液pH调至2.8，之后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，并将有机相用氮气吹干；甲醇定容至0.5 mL，用0.22 μm滤器过滤，存于带有内衬管的样品瓶待测。Rigol L3000高效液相色谱仪用于检测待测样本ABA含量，首先用流动相(甲醇∶1%乙酸水=50∶50)过Kromasil C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，待基线稳定后，加样检测，进样量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱温35 ℃，走样时间30 min，紫外检测波长254 nm，3次生物学重复。

1.2.4 JA含量测定

分别取PHYMS-1376和CK-1376 四分体、单核早期、单核晚期、二核期、三核期花药约0.1 g，用80%乙腈浸提过夜；8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，氮吹仪上冰浴吹干；加入500 μL水复溶，石油醚脱色3次；用饱和柠檬酸将pH调节至2.5～3.0，充分混匀；再用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，氮吹仪吹干；加入200 μL乙醚∶甲醇(9∶1)溶液复溶，并加入20 μL的 2 mmol·L-1三甲基硅烷化重氮甲烷的正已烷溶液混匀，室温放置30 min；加入20 μL的 2 mol·L-1冰醋酸正已烷溶液混匀，室温放置30 min，冰浴氮气吹干；加入0.5 mL甲醇，用 0.22 μm滤器过滤，存于带有内衬管的样品瓶待测。Rigol L3000高效液相色谱仪用于样本JA含量检测，首先用流动相过KromasilC18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)等度洗脱，待基线稳定后，加样检测，进样量10 μL，流速 0.8 mL·min-1，柱温35 ℃，走样时间40 min，紫外检测器波长210 nm，3次生物学重复。

1.2.5 ABA与JA通路相关基因的qRT-PCR表达分析

为验证转录组数据的准确性和进一步深入解析ABA与JA信号通路关键基因表达与SQ-1诱导的小麦生理型花粉败育之间的关系，对与ABA信号传导及JA信号传导通路相关的差异表达基因进行qRT-PCR定量分析。利用Premier 5设计qRT-PCR引物(表1)，并以18 s基因作为内参，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系：模板(500 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(μmol·L-1)各0.4 μL，2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ROXⅡ0.4 μL，ddH2O补充至 20 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；3次重复，置于Quant Studio 3 Real-time PCR System(Applied Biosystems,USA)内，规范操作，溶解曲线参照默认值。基因相对表达量采用2-△△Ct法计算，数据用SPSS 19.0处理，采用One-Way ANOVA中LSD法进行差异显著性分析。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time PCR

2 结果与分析

2.1 转录组质量检测

取SQ-1诱导的西农1376不育系及对照可育系四分体时期、单核早期、单核晚期、二核期、三核期花药，设置3次生物学重复，共30个样本进行转录组测序。经过质控筛选，共获得209.79 Gb 的Clean reads，且各样本Q30≥85.02%，对比参考基因组，比对率在70.16%～78.75%之间(表2)，结果表明，所有试验样本的测序质量良好，可用于后续研究。

表2 转录组测序结果与对比效率Table 2 Transcriptome sequencing results and alignment efficiency

2.2 差异表达基因分析

分别比对不育系及其对照可育系5个发育时期花药中基因表达数据，共获得36 058个差异表达基因，其中上调表达基因18 108个，下调表达基因17 950个。其中，三核期差异表达基因数最多，有14 978个，上调基因6 728个，下调基因 8 250个，其他依是二核期、四分体时期、单核晚期、单核早期，分别有13 832、3 697、1 946、1 605个差异表达基因；绘制韦恩图发现，不育系与其对照可育系五个发育时期花药中所共有的差异表达基因数是97个(图 1)。结果表明：SQ-1诱导小麦花粉败育过程是一个复杂的多基因参与过程，差异表达基因数受花药发育时期影响较大，且共有的97个差异表达基因参与了不育系各时期花药发育及花粉败育过程。

2.3 差异表达基因的GO功能注释与KEGG和GSEA富集分析

分别对PHYMS-1376及CK-1376四分体、单核早期、单核晚期、二核期、三核期差异表达基因进行GO分析，结果发现，每个发育时期的差异表达基因均与生物学过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)有关，且生物学过程中细胞进程(cellular process)、代谢进程(metabolic process)、单组织过程(single-organism process)，细胞组分中的细胞组成(cell part)、细胞(cell)、细胞器官(organelle)，分子功能中结合(binding)、催化活性(catalytic activities)等二级功能的基因富集比例较大。与之相比，在细胞组分中病毒(virion)、病毒组成(virion part)、胶原三聚体(collagen trimer)和分子功能中调节翻译活性(translation regulator activity)和蛋白质标记(protein tag)等二级功能在不同时期差异表达基因中均未富集到，其他二级功能基因富集比率较低，差异较大。

对PHYMS-1376及CK-1376四分体、单核早期、单核晚期、二核期、三核期花药各时期差异表达基因进行KEGG通路分析，结果发现，三核期花药差异表达基因富集到代谢通路上的数目最多，有2 518个，其次是二核期、四分体时期、单核晚期、单核早期，分别有2 313、661、387、323个差异表达基因富集到代谢通路。此外，比较分析各时期富集差异表达基因数最多的前9位通路，发现植物激素信号传导(plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)4个通路在PHYMS-1376及CK-1376花药5个发育时期均能富集到差异表达基因，且植物激素信号传导(plant hormone signal transduction)途径在四分体时期富集到差异表达基因比例最高，约占四分体时期差异表达基因总数的16%，其次是单核早期、二核期、三核期、单核晚期，分别约占对应时期差异表达基因总数的8%、6%、5%、4%。结果表明，SQ-1诱导小麦花粉败育过程是一个复杂的多通路协同调控过程，且植物激素信号传导(plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids )4个通路对引发花粉败育可能起着至关重要的作用，其中植物激素信号传导(plant hormone signal transduction)通路可能是引发后续其他通路差异表达基因变化的 关键。

利用GSEA方法富集所有与植物激素信号传导途径相关的差异表达基因，并重点关注茉莉酸(JA)和脱落酸途径(ABA)的相关基因，结果发现，24个差异表达基因被富集到了JA通路(图2-A)，23个差异表达基因被富集到了ABA通路(图2-B)。对JA通路24个差异表达基因表达量热图聚类分析发现，ID为TraesCS2A02G506500、TraesCS2B02G534800、TraesCS4A02G007800、TraesCS4D02G296000的基因表达量显著高于其他基因。对ABA通路23个差异表达基因表达量热图聚类分析发现，ID为TraesCS3A02G371800、TraesCS1A02G2159004的基因表达量显著高于其他基因。与此同时，两个通路的差异表达基因在各时期表达量存在显著差异。

2.4 JA与ABA激素含量分析

利用高效液相色谱技术检测PHYMS-1376及CK-1376花药四分体至三核期花药内源JA和ABA含量，结果发现，与CK-1376相比，JA含量在PHYMS-1376四分体花药中显著降低，至单核早期显著升高，单核晚期又显著降低，二核期显著升高，三核期显著降低(P< 0.05)；ABA含量在PHYMS-1376四分体至三核期花药中含量均高于CK-1376，其中单核早期、单核晚期和二核期二者间ABA含量差异均显著(P<0.05)。上述结果表明，PHYMS-1376各发育时期花药中JA含量的异常波动及ABA含量的显著增加，可能与SQ-1诱导小麦花粉败育紧密相关。

2.5 荧光定量PCR结果分析

对富集到的11个ABA通路的重要基因进行定量分析发现，基因表达趋势与转录组测序数据基本一致(表3)。其中，ID为TraesCS1D02G271000的基因在CK-1376四分体至二核期花药中表达量呈显著增加趋势，二核期最大，三核期则显著降低。与CK-1376相比，该基因在PHYMS-1376四分体至三核期花药中表达量均显著降低，二核期表现尤为明显，三核期表达量最高；TraesCS3B02G266200基因在CK-1376四分体至单核早期花药中表达量显著下降，单核晚期上升至最大值，至二核期再次显著下降，且二核与三核期表达量无显著差异。与CK-1376相比，该基因在PHYMS-1376四分体至单核早期花药中表达量显著升高，单核晚期显著降低，且二核和三核期表达量与对照无显著差异；TraesCS2A02G493800基因在CK-1376四分体至二核期花药中表达量较低，且差异不显著，至三核期显著增加到最大值。与CK-1376相比，该基因在PHYMS-1376四分体至三核期花药中表达量均显著增加，且四分体至单核晚期持续下降，二核期略有回升，至三核期增加至最大；TraesCS4D02G210900及其等位基因TraesCS4B 02G210100在CK-1376四分体至单核早期表达量呈显著降低趋势，单核晚期显著增加至最大值，二核期显著下降，三核期显著升高。与CK-1376相比，上述两个基因的表达量在PHYMS-1376四分体和单核晚期显著降低，在单核早期、二核期和三核期显著升高；TaABA8#OH1及其等位基因TraesCS6A02G271300和TraesCS6B02G298500在CK-1376四分体至单核早期表达量呈显著增加至最大值，单核晚期至三核期上述3个基因表达量与单核早期相比均显著降低，但单核晚期至三核期花药之间以上3个基因表达量无显著性差异。与CK-1376相比，上述3个基因的表达量在PHYMS-1376四分体和三核期显著升高，而单核早期显著降低，其余发育时期二者表达量无明显差异；TaABA8#OH2及其等位基因TraesCS5A02G238000和TraesCS5B02G236500在CK-1376四分体至单核晚期表达量显著降低至最小值，二核至三核期上述3个基因表达量显著增加至最大值。与CK-1376相比，上述3个基因的表达量在PHYMS-1376四分体、单核早期和二核期显著降低，而在单核晚期和三核期显著升高。上述结果表明，与对照CK-1376相比，11个参与ABA信号转导的关键基因的表达模式在PHYMS-1376花药各发育时期均存在不同程度的差异，可能是不育系花药中ABA含量紊乱的重要原因。

此外，对富集到的3个JA通路的重要基因进行了定量分析，结果(表3)发现，基因表达趋势与转录组测序数据基本一致。其中，TraesCS2A02G506500在CK-1376四分体至单核早期花药中表达量呈显著降低，单核晚期至三核期显著增加至最大值。与CK-1376相比，该基因表达量在PHYMS-1376单核晚期花药中显著增加，二核期和三核期表达量显著降低，在四分体至单核早期二者无显著差异；TraesCS6B02G324300及其等位基因TraesCS6D02G274700在CK-1376四分体至单核晚期花药中表达量极低，且无显著差异，至二核期表达量显著增加至最大值，三核期显著降低。与CK-1376相比，上述2个基因的表达量在PHYMS-1376二核期至三核期显著降低，其余各时期上述2个基因表达量与对照无明显差异。上述结果表明，与对照CK-1376相比，3个参与JA信号转导的关键基因的表达模式在PHYMS-1376花药各发育时期同样存在不同程度的差异，可能是不育系花药中JA含量紊乱的重要原因。

3 讨 论

3.1 基因调控通路与作物雄性不育

SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育与细胞质雄性不育及光温敏雄性不育相比，其花粉败育机理更为复杂。Liu等[16]通过转录组测序的方法对5个同核异质雄性不育小麦材料花药进行了分析，结果发现，存在27 618个差异表达基因，主要涉及81条代谢通路，如：糖代谢、氧化磷酸化、苯丙烷生物合成和磷脂酰肌醇信号通路等。Ye等[17]利用转录组测序技术对K-TCMS不育系花药进行分析，结果发现，存在16 840个差异表达基因，主要涉及苯丙醇类生物合成、茉莉酸类生物合成及MYB转录因子等。本研究利用转录组测序对SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育五个发育时期花药进行分析，结果发现，各时期共存在差异基因36 058个，涉及100多个代谢通路，其中大多数基因参与植物激素信号传导、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸的生物合成等途径。说明SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育花粉败育机理涉及的基因更多，通路更广，分子机理更为 复杂。

3.2 ABA信号通路与作物雄性不育

作物内源激素ABA含量变化与其雄性不育密切相关。Tang等[18]研究高温诱导水稻花粉败育机理时发现，随着温度的升高，水稻花粉育性降低，且花药中ABA含量与对照相比显著升高。Ji等[19]研究干旱诱导小麦花粉败育时发现，可以通过降低花药中ABA含量恢复花粉粒育性，表明调控小麦内源ABA可能会引起小麦生殖胁迫，进而诱发其雄性不育。本研究测定了CK-1376和PHYMS-1376五个时期花药中ABA的含量，结果发现，与对照CK-1376相比，ABA含量在PHYMS-1376四分体至三核期花药中含量均高于CK-1376，其中单核早期、单核晚期和二核期ABA含量均显著高于对照(P<0.05)，上述结果表明，SQ-1诱导的小麦花粉败育与花药内源ABA含量升高密切相关。上述结果同样在Ding等[20]研究三个白菜胞质雄性不育系中得到了 证实。

前人研究发现，PP2C、SnRk2蛋白与植物内源ABA信号转导密切相关。植物内源ABA可以与PYR/PYL蛋白复合体结合使PP2C失活性，进而激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，进而调节下游蛋白，进一步促进ABA信号转导与合成，相反PP2C可以作为负调控因子使SnRK2s去磷酸化，激活其与其他靶蛋白互作，进而抑制ABA信号传导与合成[21-22]。本研究富集到PP2C的关键基因TraesCS1D02G271000，对其定量分析发现，该基因在CK-1376五个发育时期花药中表达量均高于PHYMS-1376，且对照可育系五个发育时期花药中ABA含量均低于PHYMS-1376。上述结果表明，SQ-1诱导小麦花粉败育过程中，各时期花药中PP2C关键基因TraesCS1D02G271000表达量过低，致使PP2C蛋白含量减少，进一步激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，促进ABA信号转导与合成；另一个PP2C基因TraesCS3B02G266200定量结果表明，与对照CK-1376相比，四分体至单核早期，该基因在PHYMS-1376中的表达量显著较高，单核晚期显著低于对照，二核至三核期其表达量与对照无明显差异。上述结果表明，不育系各时期花药中TraesCS3B02G266200表达模式与ABA含量变化密切相关，但其表达模式不能完全支持PP2C蛋白负调控ABA信号转导理论，说明TraesCS3B02G266200基因有可能还参与其他代谢途径。SnRK2s基因TraesCS2A02G493800定量结果表明，与CK-1376相比，该基因在PHYMS-1376四分体至三核期花药中表达量均显著较高。上述结果表明，TraesCS2 A02G493800的过量表达及磷酸化，可以调节下游蛋白，促进ABA信号转导与合成。这一研究结果在Yoo等[23]研究中也得到了证实。另两个SnRK2s基因TraesCS4D02G210900及其等位基因表达模式也均支持SnRK2正向促进ABA信号转导这一理论，但上述两个基因的表达量在单核早期与这一理论相反，具体原因仍需要进一步研究。

3.3 JA信号通路与作物雄性不育

JA是一类重要的植物激素，参与了众多的生理调控过程，有大量的研究表明，JA与植物雄性不育密切相关。Keller等[24]筛选获得一株dde2-2的拟南芥突变株，表型为雄性不育，但外源喷施茉莉酸甲酯会促使花粉育性恢复，鉴定后发现，该拟南芥突变体主要是AOS基因突变。Joon-Hyun等[25]利用基因敲除技术，将拟南芥AOS基因敲除，同样获得了拟南芥雄性不育表型株，且内源JA含量非常低，但外施茉莉酸甲酯同样可恢复其育性。Wang等[26]从雄性不育小麦中克隆出了茉莉酸合成途径中重要差异表达基因TaOPR2，发现该基因表达模式可被外源茉莉酸甲酯诱导，表明TaOPR2与JA信号转导及此类型小麦花粉败育密切相关。本研究检测了CK-1376和PHYMS-1376五个发育时期花药中JA含量，结果发现，与CK-1376相比，JA含量在PHYMS-1376四分体、单核晚期及三核期花药中显著降低，在单核早期和二核期显著升高(P<0.05)。上述结果表明，JA含量异常可能与SQ-1诱导小麦产生花粉败育密切相关，除此以外JA还有可能参与其他生理代谢过程。

前人研究发现，JA信号转导相关基因的激活主要由螺旋-环-螺旋转录因子MYC2(又称JIN1)介导，当JA含量水平高时，JAZ蛋白被激素降解，当JA含量水平降低时，JAZ蛋白被激活，从而结合MYC2并且抑制其活性，之后MYC2再影响其他JA通路基因，且JA含量与JAZ相关基因表达之间存在负反馈调节[27-28]。本研究富集到JAZ基因TraesCS2A02G506500，定量结果发现，与对照CK-1376相比较，该基因表达量在PHYMS-1376单核晚期花药中显著增加，二核期和三核期表达量显著降低，在四分体至单核早期表达量与对照无显著性差异，推测TraesCS2A02G506500参与了JA信号转导，但JA含量可能受TraesCS2A02G506500与其他基因共同调节；此外，另外2个JAZ基因TraesCS6B02G324300及其等位基因TraesCS6D02G274700表达量与CK-1376相比，在二核期这2个基因表达模式与JA含量呈负相关，进一步证实JA含量与JAZ基因表达之间存在负反馈调节这一结论。Cui等[29]研究发现，SA(水杨酸)的重要复合物EDS1(enhanced disease susceptibility 1)可以与PAD4结合形成异二聚体，从而抑制MYC2活性，且MYC2被证明与JAZ相关基因表达呈负调控关系，但同时也被证实是JA合成途径中的关键正调控因子。上述结果表明，植物花药内源JA含量异常变化，与花粉粒败育密切相关，这一结果在Ye等[17]研究JA和MYB含量变化，诱发花粉壁不能正常形成，导致花粉败育中得到证实。

4 结 论

与CK-1376比较，在PHYMS-1376五个发育时期花药中共鉴定了36 058个差异表达基因，其中部分基因与植物激素信号转导途径相关性较高，检测ABA和JA含量发现，ABA含量升高与SQ-1诱导的小麦花粉败育密切相关，主要可能是因为不育系各时期花药中PP2C关键基因TraesCS1D02G271000表达量过低，致使PP2C蛋白含量减少，进一步激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，促进ABA含量增加，进而诱导花粉败育。不育系PHYMS-1376花药中JA含量及其相关基因的异常表达也可能是参与诱导花粉败育的主要因素。