植物抗冻蛋白特性及其在冷冻面团中应用研究进展

刘 玫，马 豪，郑学玲，李利民，刘 翀

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是一些生活在零度以下环境中的生物产生的抵抗冷冻威胁的蛋白，其能够与冰晶结合从而修饰冰晶形态、降低溶液冰点、抑制冰晶重结晶，因此也被称为冰结合蛋白。自20世纪60年代末在南极鱼类的血液中发现了抗冻糖蛋白以来，在许多生物中已经发现了各种类型的AFPs[1]，其中植物AFPs与其他AFPs相比有着更好的抑制冰晶重结晶活性[2]，这可能是由于植物AFPs通常含有多个亲水性冰晶结合域，似乎在吸附冰晶方面特别有效，从而在接近冰点的温度或冻融条件下阻止水分子的迁移，控制冰晶生长[3-5]。基于这个特性，植物AFPs在冷冻食品中有着很好的应用前景。

冷冻面团技术作为速冻发酵面制品的关键技术，具有工业化生产和质量标准化等优越性，有利于烘焙行业连锁经营模式的快速发展，能够减少产品老化带来的经济损失，提高产品的新鲜度和安全性[6-7]。因此，冷冻面团技术具有巨大的发展潜力。然而，冷冻面团在长期的运输储藏以及冻融过程中会经历一系列的温度波动，这会引起面团内部的冰晶生长和重结晶。有研究冻藏过程中冰晶重结晶会导致冷冻面团中主要组分产生劣变，并最终导致面团及其制品品质劣变[8-9]，如酵母细胞受到损伤、酵母活性降低，致使面团后期产气能力不足[10-11]；面筋蛋白的网络结构遭到破坏，致使面团持气能力下降[12-13]；淀粉的颗粒形态遭到破坏，理化性质产生变化[14-15]，致使面团烘焙性能下降[16-17]等。

因此，在冷冻面团品质改良的研究中，抑制其内部冰晶重结晶是非常重要的。而植物AFPs有着很好的抑制冰晶重结晶效果，因此，对冷冻面团的改良效果显著。作者综述了近年来植物AFPs的特性研究及其在冷冻面团中的应用研究进展，以期为植物AFPs在速冻面制品中的应用提供指导。

1 植物AFPs概述

1.1 植物抗冻蛋白来源

自1992年首次发表关于植物AFPs的报告以来[18]，已在60多种植物中检测到具有抗冻活性的蛋白，并提纯分析了20余种(表1)。植物AFPs主要存在于越冬植物的叶片、种子、茎、根、树皮等不同部位。不同植物AFPs的结构不相同，其抗冻活性也各有差异。

表1 不同植物的抗冻蛋白Table 1 Antifreeze proteins from different plants

1.2 植物AFPs的抗冻活性

植物AFPs的抗冻活性体现在3个方面，即：修饰冰晶形态、冰点热滞效应、抑制冰晶重结晶性，其中抑制冰晶重结晶性最为突出[36]。

1.2.1 修饰冰晶形态

冰晶有很多晶体平面，主要分为基面和棱面[37-38]。而植物AFPs主要与冰晶的棱面结合，减缓此平面附近的生长，且为AFPs结合提供更多的靶平面，从而控制冰晶生长，修饰冰晶形成温和的六边形柱晶体[1]。

1.2.2 热滞活性

与冰晶结合也是AFPs具有热滞活性和抑制冰晶重结晶活性的原因。AFPs与冰晶结合从而使其冰点降低到平衡熔点以下，导致冻结滞后，产生热滞效应[39]。植物AFPs热滞值通常较低，可能是由于植物属于耐冻物种，耐冻物种的AFPs主要作用可能是抑制冰晶重结晶，使细胞内外的冰晶保持较小，而不太可能是降低冰点[40]。因为冰点过低，过冷环境下会促进细胞内冰的形成以及快速、潜在的爆发式冰晶生长，导致细胞组织严重损伤，而在接近平衡冰点的温度下冻结可以产生更高的存活率[41-42]。因此，植物倾向于低热滞值，这可能允许更可控的冰晶生长[36]。这对于冷冻面团体系似乎也适用，控制面团内部冰晶生长，使冰晶保持细小均匀，能够减少面团所受损害。

1.2.3 抑制冰晶重结晶活性

抑制冰晶重结晶活性是植物AFPs最显著的优势。当植物的体液达到冰点时，由于非均质成核剂的存在，许多小冰晶在细胞外形成。随着时间的推移，由于Ostwald熟化效应，大冰晶以小冰晶的减少为代价逐渐生长增大，称为冰重结晶[1]。大冰晶的生长是有害的，即使它发生在细胞外，由于膜的机械损伤或脱水也会对细胞造成损伤[43-44]。而植物AFPs通常含有多个亲水性冰晶结合域，能够更有效地与冰晶结合，抑制冰晶生长且降低冰点，使冰晶不能聚集增大，从而产生显著的抑制冰晶重结晶效果。且一般只需要极低质量浓度的植物AFPs，大约1 μg/mL，即可抑制冰晶重结晶，使冰晶保持细小均匀[45-46]。抑制冰晶重结晶活性的量化通常基于抑制冰晶重结晶终点的计算。抑制冰晶重结晶终点是指仍然能阻止冰重结晶的AFPs的最低浓度。然而，抑制冰晶重结晶也可能是由AFPs以外的溶质引起的，因此，抑制冰晶重结晶分析通常在高浓度溶质(23%～30%蔗糖)下进行，以减少非特异性效应。根据以往研究，植物AFPs已经表现出最大的抑制冰晶重结晶活性，其中以黑麦草冰活性蛋白(IAP)的抑制冰晶重结晶终点最低(IAP3和IAP5为3 μg/mL，IAP2为0.6 μg/mL),其次为胡萝卜AFP(1 μg/mL)、连翘 AFP(6 μg/mL)、沙棘 AFP(12 μg/mL)和D.antarctica(15.6 μg/mL)[46]。

2 植物AFPs作用机制

植物AFPs主要是帮助植物耐受低温，而不是抵抗低温，因此对于植物中的这些AFPs更准确的说法应该是冰结合蛋白，其通过与冰晶结合，直接参与冰晶的形成过程，从而直接保护植物免受低温的影响[1]。不同来源的AFPs作用方式不同，目前提出的AFPs抗冻机制的假说有很多，如吸附抑制假说[47]、晶格匹配假说[48]、偶极子-偶极子假说[49]、刚体能量假说[50]、表面互补假说[51]等。其中吸附抑制假说很好地解释了AFPs溶液冰点滞后的原因，但吸附抑制假说所暗示的AFPs与冰晶不可逆结合的概念表明，不同类型的AFPs的活性没有差异，也没有浓度依赖性[1]。然而，许多实验表明，热滞活性(TH活性)是有浓度依赖性的，通常与蛋白质浓度的平方根成比例，且相同浓度的不同类型AFP的TH活性不同[52-53]。因此，进一步的研究认为对于只结合棱面不结合基面的AFP，TH与其结合率和溶液蛋白浓度密切相关，因为当AFP与冰晶棱面结合并阻止其棱面生长后，晶体继续在基面方向生长，直到形成双锥形状且尖端没有暴露的基面，此时，冰晶停止生长，且任何进一步的潜在生长都被溶液中的AFP阻止，这个理论既符合不可逆结合，也符合TH活性的蛋白质浓度依赖性，但不适用于结合基面的AFP；对于结合基面的AFP，其TH活性并不直接依赖于溶液中AFP浓度，而与其表面浓度更相关[54-55]。

AFPs与冰晶结合是其具有抗冻活性的根本原因，不少研究者提出了AFPs与冰晶结合的模型为锚定笼形水模型[1,56]，即AFPs冰结合面的冰结合位点可能将水组织成一种约束的冰状模型，类似于冰面附近的准液态水层，这两层类似冰的液态层随后会合并并变成冰，从而在低于熔点的温度下将AFPs冻结在冰面上，导致不可逆吸附[57-58]。这阻止了水分子从准液态层进入冰晶晶格，从而抑制冰晶生长。这也可能“钉住”了冰晶表面，抑制了融化，从而抑制了冰晶重结晶[36]。但此机制对于植物AFPs是否适用还有待研究。并且不同来源的植物AFPs其结构具有显著的多样性，抗冻活性也不尽相同，而其结构与抗冻活性之间的关系还不甚清楚，因此未来研究需要探明植物AFPs抗冻活性与其结构的关系，从而更好地利用植物AFPs。

3 植物AFPs在冷冻面团中的应用研究

在冷冻食品行业，由于冷冻、解冻和温度波动而造成的冰的生长和重结晶是导致产品质量下降的主要原因。因此,解决冰晶的生长和重结晶问题对于本行业的发展是至关重要的。冷冻面团是冷冻发酵面制品生产的关键技术，冰晶生长和重结晶会导致冷冻面团主要组分劣变并最终影响面团及其制品品质[9]。而植物AFPs具有很好的抑制冰晶重结晶效果，因此利用植物AFPs改良冷冻面团品质，具有其他改良剂所不具备的独特优势。目前，植物AFPs对冷冻面团品质改良方面的研究也较多。

3.1 植物AFPs对冷冻面团中面筋蛋白的影响

面筋蛋白通过赋予面团黏弹性、持水性以及形成面筋网络结构等对冷冻面团及最终产品的品质非常重要。然而，冷冻面团在冻藏过程中，面筋蛋白会发生解聚行为，使面团的黏弹性网络结构受到破坏，影响冷冻面团及最终产品的品质[59]。添加冬小麦AFP[60]、燕麦AFP[61]能够保护面筋网络结构，改善面筋蛋白网络中不规则空洞的形成，提高面筋蛋白的冻藏稳定性。添加女贞叶AFP能够有效抑制面团在-18 ℃冻藏期间面筋蛋白的脱水、α-螺旋减少、β-折叠和HMW/LMW增加，改善面团的流变性能[62]。燕麦AFP可以降低冻藏过程中冷冻面筋蛋白弹性模量和黏性模量的下降趋势，保护面筋蛋白的α-螺旋和β-折叠结构免受冰晶损伤，保护面筋网络结构[31,61]，且能够减缓冻融处理对小麦面筋蛋白持水性、持油性和乳化稳定性的影响[63]。另外由于天然植物AFP存在提取纯化困难、成本高和产量低等不足，刘玫[9]利用毕赤酵母GS115重组生产胡萝卜AFP(rCaAFP)，并研究了其对水合面筋在冻融循环过程中的理化性质的影响，研究发现rCaAFP减轻了GMP解聚作用，减轻了冻融循环对水合面筋二硫键、二级结构和微观结构的破坏，保护了水合面筋在冻融循环过程中的流变特性，此研究从面筋蛋白的结构和功能方面对小麦面筋在冷冻贮藏过程中的劣化过程有更多的了解，为更好地利用rCaAFP保存冷冻面团提供理论依据。综上所述，植物AFPs对冷冻面筋蛋白的结构以及流变学特性的影响的研究较多，而关于植物抗冻蛋白对面筋蛋白亚基、分子组成和功能特性的影响以及两种蛋白之间是否存在相互作用的研究还鲜有报道，因此，接下来的研究应从这几个方面更加全面深入地探明植物抗冻蛋白对冷冻面团中面筋蛋白的影响。

3.2 植物AFPs对冷冻面团中酵母活性的影响

冷冻面团在冻藏过程中，酵母的损伤和死亡最终会导致面团后期发酵能力不足，醒发时间长，且酵母损伤释放的谷胱甘肽会损伤面筋网络，导致面团持气能力不足，最终导致面团及制品品质劣变，体积小。有研究表明面团经冻融后，酵母细胞菌落数显著下降，酵母细胞谷胱甘肽释放量呈上升趋势，而添加黑麦草AFP[64]、女贞叶AFP[65]和胡萝卜AFP[66]都能够有效提高酵母的存活率，同时显著减少酵母细胞谷胱甘肽的释放量，减少面团中面筋蛋白的分解，从而有效改善冷冻面团产气持气能力。大麦籽粒AFP-1[32,67]和燕麦AFP[68]能够通过降低冷冻及冻融循环对面团弹性模量及黏性模量的破坏，保护面团面筋网络，同时降低冷冻及冻融循环对酵母产气能力的破坏从而提高面团烘焙特性，保持面包品质。

3.3 植物AFPs对冷冻面团水分特性的影响

冷冻面团中水分含量、物理状态及分布也对其品质至关重要，因为这与面团的醒发以及形成一个具有良好持气性及面包孔隙结构的终产品有很大的关系[64,69]。面团经冻融和冻藏处理后，其可冻结水含量增多，并且水分流动性增大，面团中可冻结水含量会显著影响面团的品质，可冻结水含量与冻藏期间面团中冰晶数量直接相关[70]，而冰晶是冻藏过程中淀粉面筋网络结构遭到破坏的主要因素，因而冻藏过程中面团体系中可冻结水含量的多少对面团结构至关重要。有研究发现添加大麦籽粒AFP[32]、燕麦AFP[31]、黑麦草AFP[64]和重组胡萝卜AFP[9]都能有效减缓冷冻面团含水率的下降，减弱冻融处理对水分迁移率的影响，降低面团的可冻结水含量，影响面团的水分分布，从而有效缓解面团冻藏过程中品质劣变，改善面团品质。

3.4 植物AFPs对冷冻面团烘焙特性的影响

冷冻面团在冻藏过程中主要组分的劣变会导致最终产品出现醒发时间延长、体积减小、口感变差、消费性下降等问题，这限制了冷冻面团的大规模应用。随着冻藏时间的延长，面团醒发时间逐渐增加，在冻藏5周后，空白面团醒发时间由70 min增加至107 min，而添加女贞叶热稳定冰结构蛋白的面团醒发时间由70 min增加至99 min，表明添加植物AFPs能够降低冻藏处理对面团醒发时间的延长，这可能是由于植物AFPs较好地抑制冰晶重结晶特性，减少了冰晶对酵母和面筋蛋白网络结构的破坏，从而提高了面团发酵能力和持气能力[71]。丁香丽等[32]研究发现大麦籽粒AFP也能显著缩短冷冻面团醒发时间，刘玫等[9]研究了重组胡萝卜AFP对冷冻面团醒发时间的影响也得到相似结果。由冷冻面团制得的面包和馒头的品质劣变主要体现在比容的降低和质构性质的恶化。添加0.5%女贞叶热稳定冰结构蛋白能够显著增加冷冻面团面包的比容，在冻藏1、3、5周后，与空白面团面包相比，比容增加幅度分别达到3.22%、4.69%和5.02%[71]。大麦籽粒AFP也能够显著增加冷冻面团面包比容[32]，表明添加植物AFPs能够降低冻藏对冷冻面团制品比容的不利影响。面包和馒头的质构特性与其口感密切相关，冷冻面团馒头的硬度随着冻藏时间的延长呈增加趋势，而在相同冻藏条件下，添加燕麦AFP的冷冻面团馒头硬度较之显著降低[31]。贾春利[71]研究发现，在冻藏5周后添加0.5%女贞叶冰结构蛋白的冷冻面团面包瓤比空白面团面包瓤软化了12.1%，这可能是由于添加植物AFPs降低了冰晶对面团内部结构的破坏，使制品更松软，硬度较小。冻藏处理会导致制品弹性、内聚力和回复性降低，而在添加重组胡萝卜AFP后，其降低程度显著减小[9]。

综上可知，植物AFPs较好地抑制冰晶重结晶特性，能够降低冰晶对冷冻面团各组分的不利影响，改善冷冻面团及其制品品质。

4 展望

冷冻面团在冻藏过程中由于温度波动引起内部冰晶重结晶，会导致面团品质劣变，并最终影响制品品质，这限制了冷冻面团技术的发展。因此，抑制冷冻面团冰晶重结晶是其发展道路上亟须解决的问题，而植物AFPs具有较好的抑制冰晶重结晶特性，能够很好解决这个问题，且AFPs无毒性，在多种食品中添加不会产生负面影响，其功能特性与任何毒性蛋白没有关联[72]。因此，植物AFPs将是克服冷冻面团技术瓶颈的关键因素。但是现如今对于植物AFPs作用机制、结构解析及开发应用的研究还较少，这就需要做进一步的研究，以便更好地利用植物AFPs改良冷冻食品品质。