HPLC-DAD 双波长法同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的含量

胡燕珍，黄 斌，张媛媛，陈 乐，吴先昊，虞金宝

（江西省中医药研究院，江西 南昌 330046）

乌蕨Stenoloma chusanum(Linn.) Ching为鳞始蕨科乌蕨属多年生草本植物，又称乌韭、大叶金花草、野鸡尾、金花草等[1]，生于林下或灌丛中湿地，广泛分布于长江以南各地，且北达陕西南部[2]，是一种民间常用中草药，具有清热解毒、活血利湿、止血生肌之效。现代药理学研究表明，乌蕨药理作用广泛、药用价值高，具有抗菌、抗炎、保肝、抗肿瘤、降血糖等多种生物活性[3-5]。乌蕨中含有大量黄酮类、酚酸类及挥发油等化学成分[6]。其地上部分总黄酮含量高达30%以上[7]，该类成分具有较强的抗氧化和清除自由基能力，可有效抑制脂质过氧化，其抗氧化能力与乌蕨中总黄酮含量呈正相关[8]；其中黄酮类成分牡荆苷对食管癌细胞特别是EC-109细胞增殖有明显抑制作用，能够诱导癌细胞凋亡[8]。而酚酸类化合物的药理活性也较广泛，具有抗菌、消炎、抗病毒 、抗氧化、降血脂、抗凝血等作用[9]，其中原儿茶酸、原儿茶醛具有明显的抗菌活性[10]、抗炎[11]、抗蛋白纤维化[12]、抗氧化应激[13]等作用。经查阅文献发现，目前多以牡荆苷、原儿茶酸、原儿茶醛等单一或单一类成分含量来控制乌蕨药材的质量[14-15]。由于中药成分的复杂性及药理作用的多样性，而以单个或单一类指标成分的含量来评价药材质量的优劣，未能真实、全面地反映出药材的内在质量。基于此，本研究采用HPLC技术，建立同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷三种指标性成分含量的方法，以期为后续乌蕨药材质量标准的建立提供可靠参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技 公 司）；Dikmatech Diamonsil Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm； 柱 号：2509215，Dikma Technologies）；MS105Du型十万分之一天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；103B型200 g高速中药粉碎机（浙江省瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 材料

1.2.1 试药 原儿茶酸（批号：110809-201906，纯度：97.7%，中国食品药品检定研究院）；原儿茶醛（批号：110810-201608，纯度：99.3%，中国食品药品检定研究院）；牡荆苷（批号：111687-201704，纯度：94.9%，中国食品药品检定研究院）。乙腈和甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。

1.2.2 药材 实验材料于2019年至2020年分别采集于江西各地，共计11个批次样品，经江西省中医药研究院虞金宝研究员鉴定为鳞始蕨科植物乌蕨Stenoloma chusanum(Linn.) Ching的全草，药材来源信息，见表1。

表1 样品信息Tab. 1 Sample information

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikmatech Diamonsil Plus C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱；检测波长：260 nm（原儿茶酸、原儿茶醛）、340 nm（牡荆苷）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL，见表2。

表2 梯度洗脱程序Tab. 2 Gradient elution procedure

在该色谱条件下，样品中3种活性成分（原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷）的峰与其它非被检测峰能够达到基线分离。理论塔板数按原儿茶酸峰计算不低于6 000，R>1.5。混合对照品溶液、供试品溶液色谱图，见图 1。

图1 混合对照品溶液（A、C）和供试品溶液（B、D）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed control（A/C）and sample（B/D）

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷对照品适量，加70%甲醇制成各成分对照品母液（原儿茶酸0.251 3 mg/mL 、原儿茶醛0.282 0 mg/mL、牡荆苷0.238 4 mg/mL）。再精密吸取原儿茶酸对照品母液2 mL、原儿茶醛对照品母液2 mL、牡荆苷对照品母液6 mL置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，即得原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的混合对照品储备溶液（质量浓度分别为50.26 μg/mL、56.40 μg/mL、143.04 μg/mL）。

2.3 供试品溶液的制备

取各批次乌蕨药材粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）60 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下各对照品母液，用70%甲醇逐步稀释，得到系列混合对照品溶液。原儿茶酸浓度分别为50.26、40.21、15.08、12.06、9.05、5.026 μg/mL；原儿茶醛浓度分别为56.40、45.12、16.92、13.54、10.15、5.640 μg/mL；牡荆苷浓度分别为143.04、114.43、95.36、76.29、57.22、14.304 μg/mL。精密吸取上述各溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以对照品的进样量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程、相关系数（r）和线性范围，见表3。

表3 各成分线性回归分析Tab. 3 Regression analysis of different components

2.5 精密度考察

精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录各成分峰面积，计算原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷峰面积的 RSD，分别为0.23%、0.28%、0.13%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性考察

精密吸取同一供试品溶液（批号：20200528，昌江区乌蕨）10 μL，分别于0、2、6、10、16、20、24 h进样测定，记录各成分峰面积，计算原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷峰面积的 RSD，分别为0.69%、0.61%、0.68%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性考察

精密称取同一批样品（批号：20200528，昌江区乌蕨）共6份，按“2.3”项方法平行制备6份供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定各成分含量，测得原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷平均含量分别为0.335 7 mg/g、0.406 4 mg/g、2.443 4 mg/g ，RSD分别为1.15%、1.25%、1.06%，表明该法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的乌蕨药材粉末（批号：20200528，昌江区乌蕨）6份，各约0.5 g，精密称定，分别精密加入含有原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的混合对照品溶液（原儿茶酸6.760 8 μg/mL、原儿茶醛9.493 1 μg/mL、牡荆苷39.28 μg/mL）25 mL，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定各成分含量，计算4种成分的加样回收率及RSD，见表4。

表4 回收率结果（n = 6）Tab. 4 Results of recovery rate（ n = 6）

2.9 样品含量测定

取不同产地的乌蕨样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定各成分含量，计算3种成分的含量，见表5。从乌蕨样品中3种成分含量测定结果可知，牡荆苷的含量最高（0.598 9～2.443 4 mg/g），而原儿茶酸、原儿茶醛受生长环境、采收期等影响，含量差异较明显。以3种成分的含量及总含量为指标进行聚类分析，由图2可知，当样品含量分为4类时，渝水乌蕨（S2）单独聚为一类，总含量最高（3.608 5 mg/g）；横峰乌蕨（S5）单独聚为一类，总含量最低（1.239 6 mg/g）；而浮梁乌蕨（S3）和昌江乌蕨（S4）聚为一类；其它各为一类，说明其3种成分总含量较接近。

图2 11批乌蕨药材样品的聚类树状图Fig.2 Cluster dendrogram of 11 batches of Stenoloma chusanum samples

表5 不同产地乌蕨含量测定结果（mg/g，n = 2）Tab. 5 Results of content determination of different origin of Stenoloma chusanum (mg/g，n = 2)

3 讨论

3.1 流动相的选择

参考相关文献[14-15]，本实验先后考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.4%磷酸水、乙腈-0.2%冰醋酸水等色谱条件对样品中待测成分的分离情况，结果显示有机相为乙腈时基线漂移较小且洗脱能力强；水相为0.4%磷酸水时，色谱峰分离效果好、峰形尖锐、对称性良好且理论塔板数高。综合分离情况、出峰时间、基线漂移程度、定量准确度等因素，最终确定以乙腈-0.4%磷酸水为流动相进行梯度洗脱。在该色谱条件下，样品分离度、重复性、稳定性良好，可用于乌蕨药材的质量控制。

3.2 供试品提取条件的优化

由于乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷三种成分的极性差异较大，故考察了不同浓度甲醇和乙醇对待测成分提取的效果。除此之外，提取方式、提取时间、提取溶剂量三者对药材中有效成分的提取率影响也较大，因此本实验采用单因素考察法，以原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的含量为检测指标，对提取溶剂（70%甲醇、100%甲醇、65%乙醇、95%乙醇）、提取方式（回流、超声）、超声提取时间（30、60、90 min）、提取溶剂量（15、25、50 mL）分别进行了考察。结果表明，样品以70%甲醇超声提取效率高于其它溶剂与方法。在超声时间方面考察发现，待测成分提取率由大到小依次为：超声90 min＞超声60 min＞超声30 min，但三者无显著性差异，考虑到既节约能量又保证待测成分提取完全，最终选择样品超声60 min为最佳提取时间。

3.3 检测波长的选择

采用HPLC-DAD检测器分别对三种待测成分在190 ～ 400 nm波长处进行全扫描，结果表明，原儿茶酸最大吸收波长为260 nm；原儿茶醛最大吸收波长为270 nm，但在260 nm处也有较大吸收；而牡荆苷在340 nm处有最大吸收，在此波长检测下，样品中牡荆苷响应值高，图谱基线平稳且干扰峰少。考虑到待测成分间吸收波长差异较大，为确保3种成分均能得到较好的响应，因此采用双波长同时进行检测，以便能更准确地对3种物质含量进行测定。

4 结论

本研究建立了同时测定乌蕨中原儿茶酸、原儿茶醛、牡荆苷的HPLC双波长分析方法。结果显示，原儿茶酸等3个指标成分之间含量差异较大，原儿茶酸最大值可达最小值的3倍，原儿茶醛最大值可达最小值的4.5倍，牡荆苷最大值可达最小值的4倍，其中11批样品中又以牡荆苷含量最高，为0.598 9 ～2.443 4 mg/g。而导致各地乌蕨中活性成分含量差异大的原因，可能与植物自身遗传多样性、地理位置、生长环境、土壤、光照、气温、雨量等因素有关。该方法符合定量分析要求、操作简单、灵敏度高、重现性好，且在各成分适宜波长处分别测定其含量，可明显提高测定结果的准确度。本法可作为乌蕨药材含量测定方法，可为其质量控制和质量标准的建立提供参考。