费菜组织培养体系的探讨

谢久凤， 张寒蕾， 闫睢豪， 郭阳阳， 杨亚昕， 李海霞

(河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002)

费菜又称土三七、景天三七，是景天科景天属多年生草本植物，含有丰富的黄酮类、生物碱、氨基酸、谷甾醇、维生素以及多种糖类物质，且作为食物口感极佳，具有极高的观赏价值、药用价值及食用价值[1-2]。费菜富含的黄酮类物质具有抗炎、抗氧化、抗病毒、改善记忆、调节血管渗透性、防治慢性疾病、保护DNA及抑制肿瘤细胞生长等功效，具有很高的药用价值[3-5]。市场对费菜的需求量很大，而传统的扦插和分株繁殖方式较难实现工业化大规模生产。关于费菜叶片组织培养目前鲜见报道，繁殖以扦插和分株为主，但易受季节和外界环境的影响，存在繁殖系数低、幼苗质量差和生根难的问题，严重制约着大规模的种植。利用组织培养技术可解决繁殖难问题，本试验以费菜叶片为外植体进行再生培养，建立组培快繁体系，以满足市场需求。

1 材料与方法

1.1 材料

费菜采购于郑州市陈寨花卉市场，均为健康植株。植物生长调节剂为6-BA，NAA，以75%乙醇、氯化汞进行材料消毒。

1.2 方法

采集新鲜的费菜嫩叶片→自来水加入洗洁精进行清洗→自来水冲洗5 min→蒸馏水浸泡5 min→超净台无菌环境中用75%乙醇浸泡10 s→无菌水清洗4～5次→0.1%氯化汞浸泡3～5 min→无菌水冲洗4～5次→无菌滤纸吸干水分备用。

1.2.2 培养基配制

以MS为基础培养基，配制不同培养基。

愈伤组织诱导培养基。设6个处理，T1～T3分别为6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1、0.2、0.3 mg·L-1；T4～T6分别为6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1、0.2、0.3 mg·L-1。

丛生芽诱导培养基。设6个处理，M1～M3分别为6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2、0.4、0.6 mg·L-1；M4～M6分别为6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2、0.4、0.6 mg·L-1。

壮苗培养基。MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

生根培养基。1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1。

以上培养基pH值为5.8，于115 ℃下灭菌30 min，倒入无菌组培瓶中，每瓶20～25 mL(生根培养基每瓶倒30 mL)。

5.3 去雄。为节省养分，将有限的养分集中供给植株生长发育，因此，玉米拔除多余分蘖应及早进行，以降低养分损耗，同时还可以避免损伤主茎。玉米去雄可减少植株体内的营养消耗，促使光合产物和矿物营养向雌穗输送，使穗大、粒多、子饱。去雄后，一般可增产10%左右。人工辅助授粉可减少秃顶、缺粒，一般可增产8%～10%。在玉米进入蜡熟末期，扒开玉米果穗苞叶，以促进玉米早熟，进行田间降水，提高玉米品质。

1.2.3 愈伤组织诱导培养

在无菌环境下用刀片和镊子将叶片切成直径1～2 cm的小块，背面朝上平整放入组培瓶的愈伤组织诱导培养基上，每瓶放3～4块，每个浓度做20瓶，最后将组培瓶放入人工气候培养箱中，23 ℃黑暗培养3 d后打开灯光，光照强度1 500～2 000 lx，光照培养12 h，第10和20天时观察愈伤组织生长情况，30 d后统计愈伤组织生长结果，计算不同激素浓度配比下愈伤组织诱导率。

1.2.4 丛生芽诱导培养

选取上述最佳的配比处理的松软、绿色、生长状态好的外植体，切成0.5 cm见方小块，转移至丛生芽诱导培养基上，每种浓度转接10瓶，每瓶转接4～5块外植体。在人工气候培养箱中23 ℃、光照强度1 500～2 000 lx，每天光照12 h培养。在培养10和20 d后观察丛生芽的生长情况，30 d时计算出芽率。

1.2.5 壮苗和生根培养

将获得的丛生芽切割成单芽，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，光照12 h、光照强度1 500～2 000 lx、23 ℃培养20～25 d后，选取生长高度4～6 cm、具有3～4片叶的幼苗，将其从基部切下，转至生根培养基上进行生根培养。

1.2.6 炼苗与移栽

生根培养10～20 d后，当组培苗长出5～6片叶、7～8条根时，将组培瓶从人工气候培养箱中取出，放置阳光能照射的外界环境中适应3～4 d，然后取下瓶盖炼苗3～4 d，往瓶中加入温水溶解培养基，用镊子轻轻取出小苗，用清水洗净根部黏附的琼脂，待晾干后栽入经灭菌处理的草炭土、蛭石、珍珠岩等体积混合基质中，并计算成活率。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

由图1可见，接种10 d后，在外植体切口处萌发出半透明状的绿色水珠样的微小胚状体，随后从胚状体中央抽出带绒毛的小芽，分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而生长成完整的小植株，25 d时统计诱导情况。由表1可知，T2的胚状体生长状态最好，芽体浓绿，出芽量多，健壮紧凑，故T2培养基是费菜愈伤组织诱导最适合的培养基。

图1 费菜胚状体生长情况

表1 不同培养基对愈伤组织诱导的影响

2.2 丛生芽诱导培养结果

由图2可知，费菜胚状体诱导芽培养至第10天时，丛生芽大量生长，逐渐形成完整植株，25 d时已经完全长成小植株。由表2可知，M3培养基诱导率为100%，丛生芽量多，苗健壮，生长旺盛，叶片浓绿，是费菜丛生芽诱导最适培养基。

图2 费菜丛生芽诱导情况

表2 不同培养基对丛生芽诱导的影响

2.3 壮苗和生根培养

选取生长最佳的费菜丛生芽，将其从基部切割，转至壮苗培养基上进行壮苗培养。由图3可见，培养20 d时，株高达4～5 cm，叶片浓密。将单个幼苗从基部切割转至生根培养基上进行生根培养，10 d后观察发现，幼苗基部开始形成10条左右细根；继续培养至第20天，每个幼苗下形成大量细根和须根，生根率达100%。

图3 费菜壮苗培养与生根培养

2.4 炼苗与移栽

生根培养20 d后，将组培瓶从人工气候培养箱中取出，置于外界环境中适应4 d，然后取下瓶盖炼苗4 d，并往组培瓶中加入温水溶解培养基，用镊子轻轻取出小苗，用清水洗净根部黏附的琼脂，待晾干后栽入经灭菌处理过的草炭土、蛭石、珍珠岩等体积比的混合基质中。培养30 d后，费菜成活率达90%。

3 小结与讨论

有研究选用费菜茎段进行离体快繁研究。罗林会等[6]以费菜茎段为材料，以MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.03 mg·L-1作为芽增殖培养基和生根培养基；何碧株等[7]以费菜的茎段进行离体快繁，芽诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1，芽增殖培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。本研究得出，费菜叶片愈伤组织诱导最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，丛生芽诱导最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1，壮苗培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1。

费菜组培不是分化出愈伤组织，而是半透明状的胚状体形成微小绿水珠状结构堆积在一起，即由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构；继续分化时，会从胚状体中央抽出带绒毛的小芽，进而发育成小植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体2种，胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，因其可直接生长成小植株，成苗率较高。由于胚状体的维管束是独立产生的，与母体维管束不相连，因此，可得到无病毒植株。费菜的常规繁殖系数低，生长缓慢。本试验的组织培养技术可在短期内获得大量试管苗，生长迅速，性状优良，且移栽成活率高，可实现费菜规模化生产。