慢性阻塞性肺疾病差异基因与中药预测的生物信息学分析

吴思骐 刘建博

摘要 目的：通過生物信息学技术分析比较慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者与健康人的基因芯片数据，初步筛选COPD的差异表达基因，并借助差异表达基因预测治疗COPD的潜在中药药物。方法：首先通过R分析GSE27597和GSE106986基因数据，得到139个差异表达基因，对差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析，并通过String数据库、Cytoscape软件及其插件分析得到14个核心基因，然后对核心基因进行Reactome、KEGG、PANTHER等通路注释，最后通过核心基因与医学本体信息检索平台（Coremine Medical）相互映射，筛选治疗COPD的中药。结果：通过MCODE筛选出14个核心基因包括MMP8、PTX3、DEFA4、CHRM2、FPR2、CX3CR1、FPR1、ORM1、APLNR、PPBP、CHIT1、AGTR2、ARG1，与中性粒细胞脱颗粒、先天免疫系统、趋化因子信号通路等密切相关，其中FPR1和CX3CR1通过影响中性粒细胞向肺部的迁移活动成为COPD病理变化的关键。治疗COPD的潜在中药药物包括黄连、黄芪、黄芩、半夏、丹参、厚朴、姜黄、郁金、瓜蒌等。结论：部分基因会促进香烟烟雾暴露诱发COPD的发生，通过miRNA进行调节可能是中药治疗COPD的潜在作用机制。

关键词 差异表达基因;慢性阻塞性肺疾病;微小RNA;中药;香烟烟雾

Abstract Objective：By analyzing and comparing the gene chip data of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） patients and healthy people through bioinformatics technology，the differentially expressed genes of COPD are initially screened，and the potential Chinese medicinal drugs for the treatment of COPD are predicted with the help of differentially expressed genes.Methods：The gene expression profiles of lung tissues of COPD cases and healthy cases were obtained from GSE27597 and GSE106986 of the Gene Expression Omnibus.A otal of 139 differentially expressed genes were obtained，and we performed gene ontology （GO） enrichment analysis of differentially expressed genes，and obtained 14 core genes through String database，Cytoscape software and its plug-in analysis，and then we performed Reactome，KEGG，PANTHER and other pathways on the core genes.Finally through the mutual mapping between core genes and the medical ontology information retrieval platform （Coremine Medical），we screened Chinese medicinal for the treatment of COPD.Results：A total of 14 core genes screened by MCODE including MMP8，PTX3，DEFA4，CHRM2，FPR2，CX3CR1，FPR1，ORM1，APLNR，PPBP，CHIT1，AGTR2，ARG1，and neutrophil degranulation，innate immune system，chemokines signal pathways were closely related，among which FPR1 and CX3CR1 have become the key to the pathological changes of COPD by affecting the migration of neutrophils to the lungs.Potential Chinese medicinals for the treatment of COPD include Rhizoma Coptidis，Radix Astragali seu Hedysari，Radix Scutellariae，Rhizoma Pinelliae，Radix Salviae Miltiorrhizae，Cortex Magnoliae Officinalis，Rhizoma Curcumae Longae，Radix Curcumae，Fructus Trichosanthis.Conclusion：Some genes can promote the occurrence of COPD induced by cigarette smoke exposure，and regulation by miRNA may be a potential mechanism of Chinese medicinal in the treatment of COPD.

Keywords Differentially expressed gene; Chronic obstructive pulmonary disease; miRNA; Chinese medicinal; Cigarette smoke

中图分类号：R282;R563文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.023

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmoriary Disease，COPD）是以持续性呼吸道症状和气流受限为主要特征的一种呼吸系统常见病，感染是诱发COPD急性加重的主要原因，香烟烟雾则是COPD最重要的独立危险因素[1]。COPD是全球第4大死因，根据2020年COPD全球创议（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease）可知，随着发展中国家吸烟率的升高和高收入国家老龄化加剧，COPD的发病率在未来40年仍会继续上升，至2060年可能每年有超过540万人死于COPD及其相关疾病[2]。目前COPD的基础治疗用药为吸入性支气管扩张剂，而在COPD的防治过程中，戒烟的重要性越来越得到认可。

尽管吸烟是COPD的重要诱因，但并非所有吸烟者都必然发展为COPD患者。部分COPD患者无明显的香烟烟雾暴露史，也发展为重症COPD，可见吸烟与COPD之间存在着复杂的内在关系。有研究表明，COPD具有一定的遗传性，但其具体机制尚不清楚。因此，本研究着眼于健康吸烟者与COPD患者、健康非吸烟者与COPD患者的差异表达基因，通过生物信息学分析，尝试从基因水平探寻COPD的发病因素。同时通过差异表达基因预测防治COPD的中药，并从活性单体、蛋白分子、miRNA等多个层面探讨其作用机制，从发病原因到治疗方法对COPD进行全面的剖析。

1 资料与方法

1.1 数据提取 从国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载了GSE27597和GSE106986 2个数据集。其中GSE27597包含了64例COPD患者的肺组织样本和16个来自健康供体的样本的mRNA表达谱[3]，GSE106986包含了14例COPD患者的肺组织样本和5个来自健康供体的样本的mRNA表达谱[4]。二者的表达谱来自Affymetrix Human Exon 1.0 ST GeneChip和Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2平台。

1.2 差异基因的筛选 使用R软件的注释包对2个数据集的探针ID进行转换并将二者集合并为一个数据集，利用R包（sva包和limma包）对2个数据集进行批量归一化。通过R 3.60中的limma包筛选COPD病例与对照组之间的差异表达基因，以log2 fold change（简称log2FC）的绝对值>1.0和P<0.05作为筛选标准，筛选出差异表达基因（Differentially Expressed Gene，DEG）。其中，log2FC为负数的基因为下调基因，log2FC为正数的基因为上调基因。利用R语言制作差异表达基因火山图。

1.3 差异基因的功能注释 对差异基因进行多个层面的功能注释，包括基因本体（GO）富集分析和生物过程富集分析。基因本体（GO）富集分析包含以下3个方面：细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）。借助R语言的clusterProfiler包和ggplot2包进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析和可视化。同时，通过Funrich软件（Funrich 2.1.2）寻找差异基因富集的生物通路。

1.4 核心基因的筛选和功能注释 使用STRING数据库（https：//string-db.org/）分析显著差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并将得到的PPI网络导入Cytoscape软件（version 3.8.0），利用CytoHubba[5]插件和MCODE插件进行PPI分析（筛选标准：combined score>0.4）和网络分析。MCODE可以发现PPI网络中紧密联系的区域，同时兼顾到网络边缘的分子，避免了因高通量技术带来假阳性影响，更有利于挖掘与特定功能相关的分子集合。通过KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）进行通路富集，寻找核心基因富集的通路，并通过string构建核心基因之间的交互作用网络。

1.5 靶点对接及中药预测 将筛选出的核心基因与Coremine Medical（http：//www.coremine.com/）相互映射，筛选出核心基因相关的治疗中药，根据P<0.05筛选出差异有统计学意义的中药。

2 结果

2.1 差异基因 基于GSE27597和GSE106986的原始数据，以log2FC的绝对值>1.0和P<0.05为筛选标准，共得出139个差异表达基因，其中包括62个上调基因和77个下调基因。见表1，图1。

2.2 差异基因的功能注释 GO发现上调的差异表达基因主要与中性粒细胞活化、中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞活化参与免疫反应、中性粒细胞介导的免疫应答等生物过程有关，它们介导的分子则富集于以下生物过程：碳水化合物结合、肽结合、细胞因子受体活性、G蛋白偶联肽受体活性等。见图2。在生物通路方面，差异基因富集于肽配体结合受体、整合素细胞表面相互作用、钙调神经磷酸酶调节淋巴细胞中NFAT依赖性转录等通路。见图3。且较之其他部位，这些差异基因在肺组织的表达程度更高。见图4。为差异基因与COPD的相关性提供佐证。

2.3 核心基因的筛选及功能注释 首先，以required confidence（combined score）>0.4为PPI关系的阈值，利用String数据库进行PPI分析，并下载相关TSV格式文件，得到PPI关系对文件。接着，使用Cytoscape软件的CytoHubba插件对其进行下一步分析，发掘复杂网络中的关键目标和子网络;然后使用Cytoscape软件的MCODE插件对其进行模块分析。CytoHubba分析依据degree值找到14个表达量最高的基因（CX3CR1、PPBP、PTGS2、FPR1、FPR2、VCAM1、S100A12、ARG1、EGR1、CD163、FGG、ORM1、S100A8，S100A9），MCODE分析则得到3个重要模块（MMP8、PTX3、DEFA4、CHRM2、FPR2、CX3CR1、FPR1、ORM1、APLNR、PPBP、CHIT1、AGTR2、ARG1;S100A9、VNN2、S100A12、AQP9、CEACAM4、S100A8;NR4A3、ATF3、EGR2、EGR3、EGR1、FOSB）。Hubba篩选出的模块1包含了Cytohubba筛选出的14个基因中表达量最高的4个基因，且富集于特定的功能，同时囊括了上调表达基因与下调表达基因，更能全面反映差异表达基因对COPD的影响，因此选择MOCDE筛选出的模块1所包含的14个基因作为核心基因。见图5～7。

通过KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）对筛选出的14个核心基因进行通路富集分析，其中涵盖了Reactome、KEGG、PANTHER等多个数据库。根据Reactome数据库，14个核心基因主要富集于中性粒细胞脱颗粒、先天免疫系统、免疫系统，KEGG通路方面，14个核心基因则富集于神经活性配体-受体相互作用、金黄色葡萄球菌感染、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用等通路。趋化因子和细胞因子信号转导途径介导的炎症是PANTHER预测的核心基因富集的生物过程。见表2。

将14个核心基因映射到CoremineMedical数据库，以P<0.05为筛选标准，筛选治疗COPD潜在中药，共筛选出35种可能具有防治COPD的中药。见表3。

3 讨论

3.1 COPD与健康人之间存在差异基因 尽管吸烟是COPD发病最重要的危险因素，但吸烟与COPD并非简单的线性关系。本研究综合分析了COPD与健康吸烟者以及COPD与健康非吸烟者的DEG，表明COPD的易感性与基因有关。显然，COPD并非单基因疾病，其发病与否受到多种基因的共同调节，且部分差异基因之间存在明显的相互作用。

3.2 核心基因与COPD存在着复杂关系 本研究筛选出14个核心基因，并提示CX3CR1、APLNR、CHIT1、AGTR2的高表达与COPD正相关，MMP8、PTX3、DEFA4、FPR2、FPR1、ORM1、PPBP、ARG1的低表达与COPD负相关。它们通过多种通路和生物过程，对COPD的诱发、病情进展、疾病预后起到重要的影响。而根据Cytohubba结果，CX3CR1、FPR1、FPR2、ORM1、PPBP、ARG1表达量最高，与COPD的发病关系也最为密切。

CX3CR1具有促进结构破坏和重塑的作用，在慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺气肿等慢性炎症性肺部疾病的发生发展中发挥重要作用。释放CX3CR1的趋化性炎症细胞可能导致单个核细胞在肺实质和肺血管壁聚集，释放介质诱导损伤，刺激增殖和趋化性炎症细胞[6]。单核巨噬细胞通过产生TNF-α和IL-6对香烟烟雾产生先天免疫应答，从而促进肺气肿的发生[7]，而CX3CR1作为单核巨噬细胞的产物，在这个过程中不可或缺。

FPR1的激活可触发中心粒细胞的多种功能，包括趋化性、脱颗粒、产生ROS和吞噬作用，并参与了香烟烟雾诱导的COPD炎症的发生。Leslie等[8]表明FPR1基因的缺乏降低了肺部发生炎症和纤维化的风险，同时也证明了FPR1基因表达上调对中性粒细胞产生重要影响，使之能够在肺纤维化中发挥特异性的关键作用，对于患病肺的病理组织重塑至关重要。另有研究表明，COPD患者肺中的中性粒细胞显著增多，并且中性粒细胞相关的产物与COPD的发生和严重程度相关[9]。FPR1与香烟烟雾暴露下中性粒细胞的肺部转移程度负相关也在动物实验中得到验证[10]。纤维化和肺部炎症是COPD的重要表现，香烟烟雾会导致中性粒细胞向肺内迁移从而发生炎症反应，而FPR1基因下调减少了中性粒细胞向肺的迁移，这为阐明香烟烟雾与COPD的个体差异性提供了一种可能解释。

ORM1编码的血浆蛋白在急性炎症显著增加，被归类为急性期反应物。有研究通表明AECOPD患者的ORM1的基因和蛋白质表达显著高于稳定COPD或健康对照者[11]。

PPBP能刺激滑膜细胞的纤溶酶原激活物的形成和分泌，是一种强有力的中性粒细胞趋化剂和激活剂，其在支气管黏膜的高表达可能参与了COPD的发病[11]。ARG1、FPR2与COPD的发病也有一定关系。

FPR1和CX3CR1与COPD的发病机制与病情进展密切相关，并得到深入研究，它们影响了香烟烟雾暴露情况下中性粒细胞的活动，其表达量的差异使得个体在COPD的发病和进展中呈现出不一样的转归，为揭示COPD易感性与差异性提供了遗传水平的解释。

3.3 相关中药防治COPD的潜在机制探讨

通过Coremine Medical筛选出的中药包括了临床中治疗COPD的常用药物。实验表明，相关中药及其活性分子与对COPD的治疗有积极的作用，同时它们的作用机制也与对应的核心基因密切相关。此外，部分中药可能通过影响COPD相关的miRNA而对疾病的进展产生影响，并得到了实验证明。

3.3.1 中药的活性成分治疗COPD的分子机制   有研究表明，半夏生物碱可能通过抑制TNF-α和NO等早期炎症介质的释放而保护损伤的肺上皮细胞，同时抑制IL-8和ICAM-1的表达、缓解IL-8和ICAM-1过表达而触发的中性粒细胞趋化作用，减缓中性粒细胞聚集，延缓肺损伤的发展[12]。而中性粒细胞聚集正是差异基因GO富集分析的主要通路之一。厚朴酚能通过抗氧化及抗炎作用抑制脓毒症大鼠急性肺损伤[13]，同时可通过减轻肺纤维化大鼠的肺组织纤维化程度，降低肺组织含量，达到抗肺纤维化作用[14]。另有研究表明，厚朴挥发油可能通过降低炎症组织PGE2、TNF-α和IL-1β水平从而发挥抗炎作用[15]。有研究表明，黄芪多糖可通过抑制COPD大鼠肺组织MMP9、TIMP1的表达、改善肺组织损伤及肺功能[16]。

根据中药的功能分类，预测的治疗COPD潜在靶点的药物大致可分为以下5类：止咳化痰平喘药（半夏、瓜蒌）、清热药（黄芩、大黄、黄连）、补虚药（黄芪、干姜、吴茱萸）、活血化瘀药（丹参、姜黄、郁金）、理气药（厚朴）。其中黄芪补益肺脾之气，临床研究表明，COPD患者大多有肺脾气虚，黄芪也是临床上最常应用于COPD治疗的中药之一[17]。肺脾肾虚是COPD患者最主要的病机，急性加重期患者往往受到痰热、痰湿、瘀血等病理因素的影响，预测的中药也涵盖了多种中医病理因素，体现了中医“标本兼治”的思想。瓜蒌清热涤痰，半夏燥湿化痰，而痰湿是COPD主要的病理因素及病理產物，二者联用可有效减轻COPD的症状，对COPD起到治疗作用。肺主一身之气，主宣发肃降，肺气受损，气机升降失司，则发为喘，厚朴燥湿消痰、下气除满，在COPD的治疗中得到广泛应用，疗效显著。黄芩、大黄、黄连、干姜、吴茱萸、丹参、姜黄、郁金对COPD的疗效也得到临床研究的证实[18-21]。

3.3.2 miRNA可能是中藥干预COPD进程的关键  微小RNA（microRNA，miRNA）是在多种真核细胞及病毒中发现的一类参与基因表达调控的非编码单链RNA。近期研究表明，植物来源的miRNA可以稳定地存在于动物的血液与组织器官中、并参与调控多种靶点蛋白的表达而发挥作用。尹作静等[22]发现黄连素和吴茱萸碱作用于肝癌细胞后hsa-miR-188-5p的表达量升高，而hsa-miR-188-5p与CX3CR1相关联，由此推测，黄连素可能通过上调hsa-miR-188-5p的表达干预CX3CR1的表达，从而影响COPD的进程。研究表明，丹参酮ⅡA的抗炎功效与多种miRNAs密切相关，通过下调miR-155、miR-147、miR-184、miR-29b和miR-34c表达，从而降低细胞因子、趋化因子和急性期GM-CSF、sICAM-1、cxcl-1、MIP-1α水平，抑制核因子κB活化，降低TNF-α、IL-1β、COX-2的水平，这些因子与COPD的发病及进展有着密切的关系[23]。彭先祝[24]发现参芪补肺方通过介导miRNA-146a对烟雾溶液诱导COPD效应细胞，正向调控Nrf2表达，负向调控核因子κB表达。黄芪总黄酮可通过抑制miRNA-21，增加Smad7表达，使TGF-β1/Smad激活能力下降，抑制肺纤维化中上皮细胞间质转分化的作用[25]。有研究表明，吸烟者和COPD患者的血清中miRNA-21的水平较高，并且与第1秒用力呼气容积比用力肺活量（FEV1/FVC）的呼气量负相关[26]。而miRNA-21能够促进肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，可能是COPD气道重塑的重要机制[27]。

研究表明，部分miRNA与COPD密切相关，可作为诊断和预后的生物标志物，miRNA作为COPD治疗靶点更具有广泛的应用前景[28]。部分中药可能通过调控miRNA影响COPD的病理变化，进而对COPD的发生和发展产生影响。从miRNA的层面对中药进行分析，为COPD的研究提供了新的思路，为理解COPD发生过程中的复杂分子机制提供了新的视角，也为进一步推动临床药物研发提供了依据。然而，考虑到本研究尚有一定的局限性，未来还需要进一步开展更为深入的实验验证。

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（2020-10-26收稿 責任编辑：张雄杰）