水稻富含半胱氨酸类受体激酶家族基因对纹枯病菌和植物激素的响应特征分析

冯志明 王广达 赵剑华 居冉 李梦臣 高鹏 胡珂鸣 陈宗祥 左示敏, *

水稻富含半胱氨酸类受体激酶家族基因对纹枯病菌和植物激素的响应特征分析

冯志明1, 2王广达1赵剑华1居冉1李梦臣1高鹏1胡珂鸣1, 2陈宗祥1, 2左示敏1, 2, *

(1扬州大学农学院/江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室, 江苏扬州225009;2扬州大学江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心/江苏省作物遗传生理重点实验室, 江苏扬州 225009;*通信联系人，E-mail: smzuo@yzu.edu.cn)

【目的】明确水稻富含半胱氨酸类受体激酶（Cysteine-rich receptor-like kinases，CRK）家族基因对纹枯病菌侵染和植物激素的响应特征，是解析在水稻纹枯病抗性中的功能的重要前期工作。【方法】利用生物信息学方法构建了水稻45个的系统发育树，并利用qPCR分析了它们对纹枯病菌和对植物激素乙烯（Ethylene，ET）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、水杨酸（Salicylic acid，SA）和细胞分裂素（Cytokinin，CK）等的响应特征，以及在水稻不同组织中的表达模式。【结果】水稻家族可分为4个组，在染色体上成簇或紧密分布的大部分来自同一组或同一分支。41个响应纹枯病菌侵染，其中17个响应强烈；结合组织表达模式，发现这17个基因中，、、、、、、、、和等10个基因在叶鞘和叶片中表达较强，暗示这些基因可能参与了对纹枯病的抗性；大部分同一分支的两个同源性较高的对纹枯病菌的响应特征类似, 表明这些基因在调控纹枯病抗性上可能存在功能冗余。40个对3种或4种植物激素均有响应，它们对不同激素的响应存在差异性，说明可能广泛参与这些激素介导的防御信号途径；对JA和SA响应相反的有17个，对JA和SA、ET和JA、ET和SA响应类似的分别有21、21、23个。这不仅反映了ET、JA、SA信号途径间的协同和拮抗作用，也说明这些基因可能参与ET、JA和SA间的交互作用。【结论】鉴定到一些可能参与调控水稻纹枯病抗性的基因，且它们可能在植物激素介导的防御途径中起作用。这为我们进一步探索在调控水稻纹枯病抗性上的功能提供了科学线索。

水稻；基因；纹枯病；防御相关激素；响应特征

植物生活在复杂的环境中，不断受到各种病原菌的威胁，为了抵御病原菌的攻击，植物进化出了复杂的策略，并将其转化为有效的免疫反应[1]。类受体激酶（Receptor-like kinase，RLK）在感知外界刺激、激活下游信号通路、调节细胞对病原菌侵染的反应等方面发挥着重要作用[2]。富含半胱氨酸的类受体激酶(Cysteine-rich receptor-like kinases，CRK）是植物RLK的一个亚家族，具有典型的RLK结构特征，即含有一个负责信号感知的胞外结构域、一个单程跨膜结构域和一个负责信号转导的胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。大多数CRK在胞外区有两个拷贝的未知功能域26(Domain of unknown function 26, DUF26)结构域，DUF26结构域包含三个C-X8-C-X2-C构型的保守半胱氨酸残基[3]，这些半胱氨酸可能形成二硫醇氧化还原调节的潜在靶点[4]。DUF26结构域具有感知细胞外配体和传递信号到胞内激酶结构域的作用，具有抗真菌活性，因此也被称为抗真菌应激结构域[5]。

基因在调控植物抗病性和细胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)方面起着重要作用。在拟南芥中，和受到丁香假单胞菌的快速诱导表达，过量表达或会诱发细胞PCD，植株体内病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins, PR)基因迅速表达，从而增强对丁香假单胞菌的抗性[6-7]；与同源的、和的过表达也会导致PCD[6, 8-9]；、和的过表达增强病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern, PAMP)触发的免疫反应，也增强了植物对丁香假单胞菌的抗性[10]；参与介导细胞外活性氧的产生[11]。小麦调控小麦对禾谷丝核菌的抗性[12]；水稻中参与介导的系统获得性抗性[13]；海岛棉中的参与抵御大丽轮枝菌，影响棉花对黄萎病的抗性[14]；小麦基因对小麦叶枯病菌具有广谱抗性[15]。这些研究表明，基因在植物抗病性调控中扮演重要角色。目前水稻中已报道了45个基因[14]，然而，它们在水稻抗病防御中起何作用还不是很清楚。

纹枯病是水稻最主要的病害之一，其致病菌是强腐生型立枯丝核菌(Kühn)，主要侵染水稻叶鞘和叶片，通常可造成10％～30％的产量损失，严重发生时可达50％以上[16]。全国农技推广官网（http://www.natesc.gov.cn/）中的历年数据显示，纹枯病造成的产量损失一直位于水稻各病害之首。研究发现，植物激素乙烯(ethylene，ET)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水杨酸(salicylic acid，SA)、细胞分裂素(cytokinin，CK)和生长素信号在水稻抵御纹枯病菌侵染中起重要作用[17-18]，比如，过表达转录因子和可通过激活JA/ET信号途径提高水稻纹枯病抗性[19-20]；过表达乙烯合成基因可显著提高乙烯含量，增强纹枯病抗性[21]；在水稻中导入芥菜型油菜中参与SA介导的系统获得性抗性的基因可增强纹枯病抗性[22]；SA处理可以抑制纹枯病菌在侵染过程中的增殖，从而增强水稻对纹枯病抗性[23]；渗调蛋白基因的超表达可明显提高水稻对纹枯病的抗性，并证明其与JA信号激活有关[24]；Zhang等[25]鉴定到27个抗纹枯病位点，结合候选基因分析认为JA和SA信号途径与纹枯病抗性密切相关。最近，Qiao等[18]研究发现水稻中的一个siRNA可通过影响生长素的动态平衡抑制水稻对纹枯病菌的免疫反应；我们近期的研究发现ET类物质和ET合成抑制剂处理水稻可分别增强和降低纹枯病抗性，并且证明ET受体突变体相对于野生型更感纹枯病[26]。另外，我们还发现体外喷施CK类物质或者提高水稻内源性CK的含量，可增强水稻对纹枯病的抗性[27-28]。

为了分析可能参与纹枯病抗性调控途径的基因以及它们可能涉及的信号通路，本研究系统分析了水稻中45个基因在纹枯病菌接种前后的表达变化，同时分析了这些基因在植物激素ET、JA、SA和CK处理下的表达情况和不同组织中的表达特征，为进一步研究基因在水稻对

纹枯病菌防御反应中的功能机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料和菌株

水稻材料为感纹枯病品种Dongjin，纹枯病菌菌株为本实验室一直采用的中强致病力菌株YN-7。

1.2 系统发育树的构建

从Gramene网站（http://www.gramene.org/）下载45个OsCRK蛋白序列，使用软件ClustalX 2.01进行序列比对，参数设为默认值，序列比对结果经过修正后使用MEGA 7.0软件构建“neighbor-joining”（NJ）系统发育树，bootstrap设为1000次重复。

1.3 水稻纹枯病菌培养及接种方法

水稻纹枯病菌培养及接种方法参照贺闽等[29]进行。首先将切成1 cm长、2 mm宽的0.8 mm厚的木片均匀平铺在直径为9 cm的玻璃培养皿中，加入PDB（potato dextrose broth）培养液，将纹枯病菌菌块接种于正中间，28℃下黑暗培养3 d，布有纹枯病菌菌丝的木片即为接种物。将水稻品种Dongjin在温室中培养至分蘖末期，用镊子将木片接种物嵌入自上而下第3叶叶枕下1 cm处叶鞘内侧，相对湿度控制在85%～95%，温度控制在25～31 ℃；接种后0、6、9、12、24 和48 h分别取接种位置上下1 cm叶鞘组织样品。

1.4 激素处理

水稻在温室中生长至4叶期时，分别喷施500 μmol/L乙烯利（ET）、100 μmol/L茉莉酸（JA）、8 mmol/L水杨酸（SA）及50 μmol/L细胞分裂素（CK），同时设置空白处理对照[30]，处理后0、4、12、24 h取整株水稻样品。

1.5 RNA提取、反转录和qRT-PCR分析

采用Trizol法提取各水稻样品总RNA。采用HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR（南京诺维赞生物科技股份有限公司）逆转录酶合成第1链cDNA，合成方法按照逆转录酶的说明进行。qPCR体系为：ChamQ®SYBR®qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）10 μL，PCR前后引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板2 μL（100 ng/μL），ddH2O 6 μL。采用荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96 TouchTM）进行qPCR：95℃下预变性3 min；95℃下变性15 s，60℃下退火延伸30 s，40个循环。表达值数据釆用2−ΔΔCt方法进行转换分析。内参基因（）的qPCR前引物为CCTGGCTGACTACAACATC，后引物为AGTTG ACAGCCCTAGGGTG；水稻中45个基因的qPCR引物序列见表1。

2 结果与分析

2.1 CRK蛋白的系统发育树分析

我们根据CRK家族蛋白在染色体上的位置将它们命名为OsCRK1～OsCRK45(表1、图1)，它们的长度和分子量分别为163～897个氨基酸和18.63～95.79 kDa；21个CRK蛋白的理论等电点(pI)呈弱酸性(4.38～6.99)，23个呈碱性(7.04～10.58)，1个中性(7.00)。

我们进一步构建了CRK蛋白的系统发育树（图1-A），根据进化关系的远近，这些蛋白可以分为两个主要簇，第一个主要簇分为3个次要组，第二个则为1个次要组，因此，系统发育树可将CRK蛋白分为4个组：组Ⅰ～组Ⅳ。有趣的是，结合CRK在染色体上的分布（图1-B），我们发现在染色体上成簇或紧密分布的CRK大部分来自同一组或同一分支。例如，第7染色体上的8个成簇分布的CRK中有7个属于组Ⅰ，且多数属于同一分支（如CRK25和CRK28，CRK26和CRK27等）；第12染色体上的4个成簇分布的CRK蛋白都属于组Ⅲ，其中CRK44和CRK45属于同一分支；第4染色体上紧密分布的CRK10和CRK11属于组Ⅲ，CRK13和CRK14属于组Ⅳ中的同一分支；第12染色体上的CRK40和CRK41属于组Ⅱ的同一分支；第9染色体上的CRK32和CRK33属于组Ⅲ；第11染色体上CRK38和CRK39属于组Ⅱ。

2.2 CRK基因在纹枯病菌侵染后的表达特征

为了解基因对纹枯病菌侵染的响应特征，选择感病品种Dongjin进行温室分蘖末期纹枯病菌接种，在接种后0、6、9、12、24、48 h取叶鞘组织分析各基因的转录水平。如图2所示，我们将倍数变化（Fold change，）≥1.5或≤0.67（即|Log2|≥0.58）的基因定为显著变化基因。我们发现45个基因中响应纹枯病菌的基因有41个，其中受诱导上调表达的基因有19个，下调表达的有22个，、、和不响应纹枯病菌；受诱导上调表达基因主要集中在组Ⅰ和组Ⅳ中，受诱导下调表达基因主要集中在组Ⅱ和组Ⅲ中。根据响应时期，早期受诱导（在纹枯病菌接种后12 h之前受诱导，包括12 h）上调的基因有、和，下调的有、、、和；晚期受诱导（在纹枯病菌接种后12 h之后受诱导）上调的基因有和，下调的有、、、和；持续受诱导（早期和晚期都受诱导）上调的基因有、、、、、、、、、、、、和，下调的有、、、、、、、、、、和。根据响应强度，受诱导上调表达强烈（其中一个时间点上调表达4倍以上）的基因有、、、、、、、、、、和，受诱导下调表达强烈（其中一个时间点下调表达4倍以上）的基因有、、、和。进一步，发现同一分支的两个同源性较高的基因受纹枯病菌诱导表达特征类似，比如，同一分支的和、和、和等受诱导上调表达特征类似，同一分支的和、和等受诱导下调表达特征类似。

表1 水稻OsCRK基因家族及其荧光定量PCR引物