肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型感染手足口病患儿血清基质金属蛋白酶-9、白细胞介素-1β、白细胞介素-10水平变化及临床意义

陈 芳，宋春兰，陈 梅，朱 琳，崔亚杰，成怡冰，付书琴，崔君浩

(郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院急重症医学科，郑州市儿童急危重症医学重点实验室，河南 郑州 450003)

手足口病(hand-food and mouse disease,HFMD)为一种肠道病毒感染引起的传染病[1]。朱敏杰等[2]调查显示，389例HFMD患者中肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackie virus A16,CA16)感染分别占30.59%、21.34%，其他肠道病毒感染占48.07%。EV71病毒感染有暴发流行特点，其神经毒性可引起严重中枢神经系统并发症，出现无菌性脑膜炎、脑脊髓膜炎与急性迟缓性麻痹等，甚至死亡[3]，准确对其进行诊断和评估病情有重要意义。在HFMD发生发展过程中，机体细胞免疫与体液免疫会发生复杂变化，而细胞免疫为免疫系统重要组成部分，机体感染病原体后，体液中迅速产生大量细胞因子，并对机体产生免疫攻击[4]。其中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)为基质金属蛋白酶家族成员之一，参与机体血管形成与创伤愈合，与神经系统炎症反应密切相关[5]。白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)参与脑组织破坏、脑水肿形成等多种继发性脑损伤炎症反应过程[6]，有广泛诱导炎症反应与调节免疫的作用。但目前关于血清MMP-9、IL-1β、IL-10与HFMD患者的关系研究甚少。本研究主要分析EV71、CA16感染的HFMD患儿血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平变化，探讨HFMD发生发展的机制，以期为全面评估HFMD患儿的各脏器功能并尽早进行干预和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年4月至2019年4月郑州大学附属儿童医院收治的肠道病毒感染HFMD患儿72例为研究对象。纳入标准：(1)符合HFMD诊断标准[7]；(2)经实验室病毒检测确定为EV17或CA16感染，均为1种病毒感染；(3)无重大器官损伤且未接受院外治疗；(4)患儿临床资料齐全。排除标准：(1)有神经系统、呼吸系统、内分泌系统或血液系统疾病史者；(2)除EV17或CA16感染外有其他病毒感染的患儿；(3)入院前接受过其他药物治疗的患儿。根据感染的病毒类型将患儿分为EV71组(n=32)和CA16组(n=40)。另选择同期入院体检的健康儿童30例为对照组，均无胃肠道、神经系统、呼吸系统、血液系统疾病。EV71组32例，男19例，女13例；年龄1～4(2.94±0.32)岁;病情程度[7]：轻度15例，重度17例。CA16组40例，男27例，女13例；年龄0～4(3.05±0.36)岁；病情程度：轻度21例，重度19例。对照组30例，男16例，女14例；年龄1～4(2.96±0.34)岁。3组患儿的性别分布、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准，患儿监护人均知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察指标(1)临床资料:记录EV71组和CA16组患儿入院前7 d内的病程、热程，计算临床症状发生率；(2)血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平:于入院第2 天抽取所有患儿晨起空腹静脉血3 mL置于EP管中，1 000 r·min-1离心(离心半径10 cm)15 min，分离血清，置于-20 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附试验测定受试者血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平，试剂盒均购自上海易利生物科技有限公司，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 EV71组和CA16组患儿临床资料比较结果见表1。EV71组患儿病程、热程显著长于CA16组，差异有统计学意义(P<0.05)。EV71组与CA16组患儿的手足部出疹发生率比较差异无统计学意义(χ2=0.981，P>0.05)。EV71组患儿嗜睡、易惊、肢体抖动发生率显著低于CA16组，差异有统计学意义(χ2=5.113、4.194、4.500，P<0.05)；EV71组患儿咳嗽、惊厥、呕吐、肌肉挛缩发生率显著高于CA16组，差异有统计学意义(χ2=8.937、4.800、8.733、5.946，P<0.05)。

表1 EV71组和CA16组患儿临床资料比较

2.2 3组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比较结果见表2。EV71组和CA16组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。EV71组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于CA16组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比较

2.3 EV71组和CA16组不同病情程度患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比较结果见表3。EV71组和CA16组重度患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于轻度患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。CA16组轻度患儿血清MMP-9水平显著低于EV71组轻度患儿，差异有统计学意义(P<0.05)；CA16组重度患儿血清MMP-9水平显著低于EV71组重度患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。2组轻度和重度患儿的血清IL-1β、IL-10 水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 EV71组与CA16组不同病情程度患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平比较

2.4 EV71组和CA16组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平与病情程度的关系EV71组患儿血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平与病情程度呈正相关(r=0.345、0.412、0.309，P<0.05)。CA16组患儿血清MMP-9、IL-1β与病情程度呈正相关(r=0.405、0.367，P<0.05)，血清IL-10水平与病情程度无明显相关性(r=0.135，P>0.05)。

3 讨论

HFMD为一种易感染低龄儿童的急性传染病，常起病急、病情发展快、临床表现多样化，EV71和CA16为引起HFMD的主要病原体，其中EV71在HFMD发病中占据重要地位，可引起中枢神经系统受损，因而了解2种肠道病毒感染患儿临床特征及机制有重要临床意义[7-9]。机体遭受病毒感染后，体内可分泌大量细胞因子，因此多种细胞因子可能参与患儿HFMD的发生发展。正常细胞内仅有微量MMP-9表达，因而MMP-9过多分泌常提示存在神经细胞破坏及脑组织损伤[10]。刘感哲等[11]研究显示，MMP-9水平升高可促进血脑屏障组织中细胞间质成分中胶原纤维降解，增加其通透性，促进病情进展。因此，HFMD患儿病情进展可能与MMP-9水平有关。此外，机体感染病毒后也会释放多种细胞因子，如IL-1β、IL-10，其中IL-1β为具有多种生物学功能的细胞因子，对免疫应答与炎症反应有重要调节作用[12-13]，但其与HFMD发病的关系研究甚少。

本研究结果显示，EV71组患儿病程、热程显著长于CA16组，EV71组患儿嗜睡、易惊、肢体抖动发生率显著低于CA16组，EV71组患儿咳嗽、惊厥、呕吐、肌肉挛缩发生率显著高于CA16组，与谢瑞玉等[14]的报道结果一致；表明EV71感染的HFMD患儿病情可能较CA16感染患儿更严重，且发病不易被察觉，尤其是神经系统症状(嗜睡、易惊、肢体抖动等)不明显，需及时诊治；而CA16感染的HFMD患儿发病后更易被察觉，可及时接受治疗，可能与CA16病毒载量低有关。但也有研究发现，EV71及CA16感染的HFMD患儿病毒载量与病情无明显相关性[15]，因此仅依据临床表现或病毒载量难以对HFMD进行准确诊断。

相对稳定的免疫平衡状态对维持机体正常功能有重要意义，而HFMD患儿感染病毒后，机体免疫平衡被破坏，体内出现免疫紊乱[16]。本研究结果显示，EV71组和CA16组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于对照组，EV71组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于CA16组；表明EV71或CA16感染均会影响HFMD患儿的免疫功能，而EV71感染对HFMD患儿免疫功能影响更大，神经组织受损更严重，这可能是因为EV71为小核糖核苷酸病毒科单正链RNA病毒，其引起的HFMD患儿病情发展较快[17]。促炎因子如IL-1β是引起发热、激活神经内分泌与自主神经系统的最强促炎因子，其可经c-Jun氨基末端激酶、蛋白激酶C等信号通路转导途径与转录因子核因子-κB调节基质金属蛋白酶表达水平。IL-1β可通过激活MMP-9而介导神经细胞死亡或发挥神经毒性作用，在颅脑损伤、颅内感染者中IL-1β的表达水平、活性均呈显著增高趋势。因而检测IL-1β、MMP-9可反映脑组织内炎症反应情况[18-19]。IL-10为抗炎因子，其主要由辅助型T细胞2及B细胞分泌，对促炎因子有调控作用。王玉洁等[20]研究发现，EV71感染的HFMD患儿血清中IL-10呈高表达。本研究结果显示，EV71组患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于CA16组；说明EV71感染后既存在免疫抑制也有免疫亢进，即分泌促炎因子也分泌抗炎因子，使机体处于复杂的免疫功能紊乱与动态平衡，因此全身免疫性炎症反应可能是其发生发展的病理机制；同时不同肠道病毒毒力、嗜神经性、免疫反应及感染后引起体液因子水平变化差异大，这也可能是EV71组患儿细胞因子水平升高较CA16组更明显的原因。

本研究结果显示，EV71组和CA16组重度患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平显著高于轻度患儿，表明HFMD病情进展与MMP-9、IL-1β及IL-10等细胞因子密切相关，且不论是EV71还是CA16感染均检测到这种趋势，提示MMP-9、IL-1β及IL-10可作为HFMD患儿病情诊断的指标。正常情况下细胞因子水平较低，当机体受到病毒等攻击后，会刺激免疫细胞分泌细胞因子，分泌的炎症因子持续作用可导致胶质细胞与神经元破坏，使细胞水肿变性、坏死溶解，血脑屏障通透性升高，血液中细胞因子进入脑脊液，细胞因子大量持续存在对神经细胞进一步造成破坏，从而使病情恶化[21]，因此，随病情加重可检测到HFMD患儿血清MMP-9、IL-1β及IL-10水平升高，这可能也是本研究Spearman相关分析中EV71组、CA16组患儿MMP-9、IL-1β水平与病情呈正相关的原因。CA16组患儿IL-10水平与病情无明显相关性，一方面可能与EV71感染机体后直接造成的组织细胞破坏有关，另一方面可能与机体感染EV71后所发生的异常免疫应答有关，二者最终可导致组织细胞与器官损害[22]。

综上所述，HFMD患儿尤其是EV17感染患儿的血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平显著升高，且其中MMP-9、IL-1β与患儿病情程度呈显著正相关，临床可对HFMD患儿血清MMP-9、IL-1β、IL-10水平进行监测，以辅助诊断HFMD感染类型。