山东省大蒜主产区根腐病病原菌分离与鉴定

高园园 张龙平 任艳云 朱庚振 刘国伟 王南南

摘要：为进一步探讨山东省大蒜主产区根腐病的病原菌及种类，于2020年从山东省济宁市任城区、金乡县，菏泽市巨野县，临沂市兰陵县等采集发病大蒜植株，通过组织分离法获得4株分离物，利用形态学鉴定方法，结合Blast同源性分析，利用MAGE 7.0构建系统发育树的方法对分离物进行鉴定。结果表明，尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰孢菌（F. solani）、芳香镰孢菌（F. redolens）、木贼镰孢菌（F. equiseti）是山东省大蒜主产区根腐病的致病菌。通过对比4种镰孢菌对大蒜根腐病的致病性发现，分离出尖孢镰孢菌的植株根腐病最为严重，可见尖孢镰孢菌是大蒜根腐病病害的主要致病菌。结果可为大蒜根腐病拮抗菌的筛选和防治及大蒜——根腐病互作机理研究提供理论依据和技术参考。

关键词：大蒜;根腐病;尖孢镰孢菌;病原菌鉴定;腐皮镰孢菌;芳香镰孢菌;木贼镰孢菌

中图分类号：S436.33   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）14-0086-04

大蒜（Allium sativun L.）为百合科葱属一年生或二年生草本植物，原产于西亚和中亚，汉代张骞出使西域带回我国[1]，至今已有2 000多年的种植历史[2]。大蒜性温味辛，富含营养物质，是人们生活中重要的蔬菜和调味品。据统计，我国是世界上大蒜种植面积最大、产量最高的国家[3]，大蒜种植成为多数地区经济发展的重要支柱性产业和出口创汇农产品之一[4]。近年来随着大蒜产业的发展和效益的增加，在大蒜主产区由于连作、管理不善等因素影响，大蒜病害呈现高发态势[5]，尤其是大蒜根腐病较为严重，影响大蒜的产量和品质。已有研究表明，根腐病发生是由多种病原菌混合侵染造成的[6]，比如牡丹根腐病病原菌是茄腐皮镰刀菌（Fusarium solani） 、链格孢菌（Alternaria spp.） 、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等;甜瓜、黄瓜、苜蓿等作物的根腐病病原菌是茄腐皮镰刀菌;宁国山核桃根腐病的病原是尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）。有关大蒜根腐病的病原，前人进行了一定研究，已知的有真菌性和細菌性病原菌。张博等通过对病株进行分离和致病力测定，确定致病菌是腐霉（Pythium）[7];而有的研究则认为大蒜根腐病是由镰刀菌属的真菌引起的，其中尖孢镰刀菌是致病的优势种[8];有的研究则认为大蒜根腐病属细菌性病害，是大蒜软腐病的一种[9];由此可见，导致大蒜根腐病的致病菌在不同地区存在差异。本研究以大蒜根腐典型发病植株为供试材料，采用组织分离法对病原菌进行分离纯化，运用菌落形态学和分子生物学相结合的方法进行鉴定，以期明确导致大蒜发生根腐病的病原菌种类，旨在为大蒜生长过程中根腐病病害的有效防治提供理论基础和技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品来源

于2020年从山东省济宁市任城区、金乡县，菏泽市巨野县，临沂市兰陵县等大蒜种植主产区采集发病的植株样品，将以上样品保存于无菌采样袋中，立刻到实验室进行病原菌分离。

真菌固体培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离纯化 采用常规组织分离法进行病原菌分离[10-11]，取患根腐病的大蒜植株，流水冲洗根部30 min，75%乙醇浸泡1 min，3%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干。取病健交界处用无菌刀切2 cm小段接种于PDA培养基，28 ℃培养5～7 d，挑取边缘菌丝转接纯化。

1.2.2 菌株的致病性测定 斜面保存的菌株接种到PDA液体培养基中，28 ℃、160 r/min摇床培养 7 d，制成107个孢子/mL的孢子悬浮液，用于接种备用，装有基质的组培瓶灭菌后备用。采集苗期大蒜植株，用流水冲洗20 min，乙醇消毒鳞茎和根部 1 min，无菌水冲洗5次，移栽到灭过菌的基质中，加入25 mL菌悬液灌根，对照组接无菌水培养，观察接种后的发病情况。根据科赫法则，对发病的植株再次进行病原菌分离，并与原接种菌株进行比较。

1.2.3 菌株鉴定

1.2.3.1 形态观察 将分离到的致病菌接种到PDA培养基上，28 ℃培养5 d后观察菌落形态。挑取菌丝进行菌体显微观察，参照《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定[12]。

1.2.3.2 ITS序列分析 将纯化培养好的菌株用真菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行扩增。PCR反应体系为：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，DNA 片段经胶回收试剂盒回收，将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。

1.2.3.3 构建系统发育树 从NCBI网站下载与待测菌株相似的序列，通过CLUSTAL_X （version 1.81）[13]进行序列比对，去除冗余序列。用邻接法（neighbour-joining，NJ）[14]在MEGA 7.0[15]软件中构建系统发育树，设定值Bootstrap均为500次。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化结果

通过组织分离法从发病大蒜植株中分离到4株菌落形态特征不同的真菌菌株，依次编号为55R-1、BR917-3、JSS6、LZR，进一步分离纯化培养后，进行菌落形态鉴定和分子生物学鉴定。

2.2 菌株致病性测定

采用科赫法则进行致病性验证，将分离到的菌株重新接种到健康大蒜植株上。接种7 d后，分别接种不同病原菌分离物的植株均呈明显干枯症状，根部呈腐烂状（图1）。对根部发病部位重新分离病原菌，分离结果与原接种真菌一致。根据科赫法则，证明接种的真菌55R-1、BR917-3、JSS6、LZR是引起大蒜根腐病的致病菌。

2.3 菌株鉴定

2.3.1 形态特征鉴定 菌株55R-1菌落颜色呈白色，菌落背面为浅黄色，生长速度中等，菌丝白色、絮状、致密。大分生孢子纺锤形，有横隔，1～3隔常见，小分生孢子棒槌形（图2）。

菌株BR917-3菌落颜色呈白色，菌落背面呈黄色，中心区域菌丝隆起，絮状茂盛，边缘菌丝颜色稍暗。大分生孢子细长，镰刀型或纺锤形，1～3 个隔膜，两端细胞尖或稍弯，小分生孢子纺锤形或者椭圆形（图3）。

菌株JSS6菌落颜色呈白色，菌落背面为土黄色。菌丝白色、密实、边缘齐。小孢子长椭圆形，大孢子顶端渐尖，呈镰刀状，多数3隔（图4）。

菌株LZR菌落呈同心环状，初期颜色为浅白色，在生长后期中心圆环区呈土黄色，菌落背面黄色。大型分生孢子呈镰刀型，1～3横隔，小型分生孢子呈卵圆形或柱形，偶有横隔（图5）。

2.3.2 ITS序列分析 对PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果见图6，扩增条带大小在510～540 bp之间。

将4个菌株ITS序列进行Blast同源性分析，利用MEGA软件构建系统发育树，结果如图7所示。菌株55R-1与芳香镰孢菌（F. redolens）表现出最高相似度（100%）且聚在一支，结合菌落形态及显微观察结果，鉴定菌株55R-1为芳香镰孢菌;菌株JSS6与木贼镰孢菌（F. equiseti）的同源性最高，相似性100%且与该物种其他菌株均聚在一支，结合菌落形态及显微观察结果，鉴定菌株JSS6为木贼镰孢菌;菌株BR917-3与尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的相似性最高（100%）且聚到一支，结合菌落形态及显微观察结果，鉴定菌株BR917-3为尖孢镰孢菌;菌株LZR与腐皮镰孢菌（F. solani）的其他菌株均聚到一支且表现出最高相似性（100%），结合菌落形态及显微观察结果，鉴定菌株LZR为腐皮镰孢菌。

3 讨论

近年来由于市场需求增大，大蒜种植盲目扩大生产，连作、病害、种质资源退化等已成为山东省大蒜生产的主要限制因素[16]，尤其是土传病害已严重制约和影响大蒜的产量提高和品质改善。张丽等研究表明，土传病害的病原菌种类和数量与气候、土壤类型及生物因子等密切相关[17]。前人对大蒜根腐病的致病菌进行了大量研究，但不同地域的研究者分离得到的病原菌却不尽相同[16]，可见不同区域大蒜根腐病的致病菌存在明显差异。本研究从山东省3个地市4个县（市、区）取样大蒜根腐病病株，通过形态学和分子生物学鉴定均为镰孢菌属，分别为尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、芳香鐮孢菌、木贼镰孢菌，可见镰孢菌属是山东省大蒜主产区根腐病的致病菌。但从分离地理区域来看，不同地域所分离到的分离物种类存在明显差别[18]，究其原因可能与各县（市、区）的地理位置、气候因素和耕作制度等密切相关[11]。本研究的取样区域多采取大蒜连作种植模式，该种植模式致使土壤地力下降，自身有毒物质不断积累，造成微生物群落结构和优势菌群发生明显变化，加剧根腐病等土传病害的发生[16]，这与张丽娟等的研究结果类似[8]。

同一种属不同种类的致病菌对根腐病的致病效果差异明显，本研究通过对比尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、芳香镰孢菌、木贼镰孢菌对大蒜根腐病的致病性发现，分离出尖孢镰孢菌的植株根腐病较为严重，分离出腐皮镰孢菌、芳香镰孢菌、木贼镰孢菌的植株根腐病较轻，可见尖孢镰孢菌是该病害的主要致病菌。下一步笔者所在课题组将通过盆栽和大田试验，进一步研究在不同生长时期尖孢镰孢菌对大蒜根腐病的致病机制，同时开展针对该病害的抗病品种选育和种苗繁育工作，筛选高效防治药剂[19]，以期为防治山东省大蒜主产区根腐病提供理论依据和技术支撑。

4 结论

综上，尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、芳香镰孢菌、木贼镰孢菌均可导致山东省大蒜主产区大蒜根腐病的发生，尤其是尖孢镰孢菌是该病害的主要致病菌。本研究能为开展山东省大蒜主产区根腐病病害的深入研究和防治工作奠定理论基础，为解决大蒜根腐病识别及科学防治提供了一定的参考，对提高大蒜产量和改善大蒜质量意义重大。

致谢：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（161013201704）资助。

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