不同大樱桃品种营养成分分析及体外抗氧化作用研究*

郭 艳，周小魏，吕佳欣，熊仁次，王振华

（1 烟台市科技创新促进中心，山东264003）（2 塔里木大学植物科学学院）（3 烟台大学生命科学学院）

樱桃（Cerasusspp.），又名车厘子、英桃和莺桃，是蔷薇科（Rosaceae）樱属（CerasusMill.）植物。自古以来，樱桃就是果中之珍品，果实色彩鲜艳、小巧玲珑，为人们所喜爱[1]。中国樱桃原产于我国，在我国有2 000 多年的栽培历史，且分布广泛，主要生长于山东、河南、江苏、浙江、江西、四川等地[2]。樱桃果实成熟期早，享有“早春第一果”的美誉，其色彩亮丽，汁多肉厚，营养丰富。果实性温、味甜，有调气活血、调中益脾、平肝祛热之功效[3]。樱桃中含有丰富的花色苷、p-香豆酸、没食子酸、堪非醇、紫苏醇、褪黑激素和槲皮素等天然的具有保健功能的成分[4]，具有抗氧化、缓解关节痛和痛风、降低心血管疾病的风险、防治癌症、控制糖尿病及其并发症、调节生理节律、提高睡眠质量及大脑保健等作用[5]；另一方面，每百克樱桃中含铁多达59 mg，居于水果首位。樱桃中具有保健功能的成分被分离、分析与鉴定，研究发现樱桃具有相当高的抗氧化能力[6-8]。

本文通过分析山东省烟台市及其周边不同大樱桃品种的营养成分，并探索大樱桃粗提物对大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用，以期为大樱桃的加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料购买于山东省烟台市田园大樱桃专业合作社，分别采摘成熟期的‘意大利红’‘美早’‘先锋’‘红灯’‘水晶’‘拉宾斯’和‘萨米托’7个大樱桃品种，每个品种各15 kg，用于测定营养成分和提取花色苷等。

柠檬酸（Sigma）、硫酸（烟台双水化学有限公司）、钼酸铵（天津大茂有限公司）、冰乙酸（天津百世化工有限公司）、草酸（Sigma）、蒽酮（Sigma）、乙醇（山东禹王有限公司）等试剂均为分析纯。

1.2 试验仪器与设备

JJ-2 组织捣碎匀浆机，HH-2数显恒温水浴锅（金坛市科兴仪器厂），旋转蒸发仪RE-5205（上海亚荣生化仪器厂），真空冷冻干燥机（北京亚星仪科科技发展有限公司），AR2130电子天平（Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA），Micro 21R 高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific Inc)，酶标仪（Molecular Devices Corporation），FACSAria 流式细胞仪（Becton Dickinson），恒温二氧化碳培养箱（SANYO）。

1.3 试验方法

1.3.1 营养指标的测定

总糖含量用蒽酮指示剂法测定，可滴定酸含量用酸碱滴定法测定，维生素C含量用钼蓝比色法测定，蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250 染色法测定，总酚含量采用Waterhouse方法测定，类黄酮含量采用直接测定法以黄酮类化合物为对照测定其含量，总花色苷含量采用pH示差法测定。

1.3.2 总花色苷的提取

酸化乙醇法提取：选果30个左右，洗净、沥水、称重、去核，打浆放置于锥形瓶中，称取10 g匀浆液，柠檬酸浓度8 g/L（溶剂为50%乙醇），料液比1∶3，时间3 h，乙醇浓度50%，温度60 ℃，4 000 r/min 离心10 min，取上清液，减压浓缩至2～3 mL，膏状，真空浓缩干燥，得到大樱桃总花色苷提取物。

1.3.3 抗氧化能力的测定

（1）DPPH自由基清除试验。DPPH自由基清除活性，制备提取液，将0.1 mL 稀释至合适倍数的样品提取液或标准品溶液与3.9 mL 60 mmol/L DPPH测定液混匀后避光室温反应2 h，测定515 nm处的吸光值。标准曲线为Trolox 用甲醇（含1%甲酸）落解并稀释至25、50、75、100、125、150、175、200μg/mL 浓度梯度。DPPH自由基清除活性以mg Trolox/100 g 表示。

（2）羟基自由基清除试验。Fenton反应是生成羟基自由基的常用方法。分别取0.2 mol/L FeSO4溶液、2 mmol/L 水杨酸及稀释的2 mg/L 不同提取液各1 mL 混合，编号1～7号，以中国毛樱桃抗氧化提取物以及维生素C为对照，分别在8、9号管中加入1 mL 的2 mg/L 对照样品混合。最后分别加入6 mmol/L H2O21.0 mL，以蒸馏水定容至10 mL 启动反应，空白以蒸馏水代替。37℃水浴反应1 h后，在λ＝520 nm 下测定OD 值。

（3）超氧阴离子清除试验。取试剂a（1 mol/L HCl 48.0 mL，Tris 36.6 g，EDTA 0.23 mL，加蒸馏水定容至100 mL）与试剂b（0.14 g 过硫酸铵加蒸馏水定容至100 mL），按照1∶4混合产生超氧自由基。1 min后，分别吸取2 mL 混合液至编号为1～8号的试管中，分别加入1 mL 稀释的2 mg/L 的不同大樱桃品种的抗氧化提取物，以维生素C为对照，分别在9、10 号管中加入1 mL 的2 mg/L 对照样品。空白以蒸馏水代替，加10 mmol/L 盐酸羟氨胺0.4 mL混合，25℃反应30 min。再加入17 mmol/L 的对氨基苯磺酸和7 mmol/L α-萘胺各2 mL，25℃反应30 min。反应显色后加入7.4 mL 的正丁醇，充分摇匀，静置分层。取正丁醇相，在λ＝520 nm下测定OD值。

1.3.4 对心肌细胞的保护作用试验

大鼠心肌细胞H9C2（购自中国科学院上海细胞库）以1×106个/mL 密度接种于6 孔板中，待生长至80%～90%融合度时，加入30 μg/mg 浓度大樱桃提取物（经0.45μm 微孔滤膜过滤除菌，空白组和模型组加入等量的DMEM培养基）孵育24 h后，再加入DCFH-DA探针孵育30 min 后，加入300 μmol/L 的H2O2溶液，处理2 h，488 nm、529/590 nm酶标仪荧光检测活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成。

1.4 数据分析

试验数据采用GraphPad Prism 7 进行数据整理和作图。

2 结果与分析

2.1 营养成分的分析

由图1可知，总糖含量，‘水晶’最高，为29.68%，其他6 个大樱桃品种的总糖含量均为20.00%左右；可滴定酸含量，‘水晶’略低，为0.51%，其他6个大樱桃品种的可滴定酸含量为0.60%～0.90%；维生素C含量，‘先锋’最高，为400 mg/kg，其次为‘红灯’和‘拉宾斯’，含量略高于其他品种；类黄酮含量，‘意大利红’最高，达1.1 mg/g，而含量最低的‘水晶’为0.6 mg/g；总酚含量，‘先锋’和‘拉宾斯’较高，分别为2.6、2.5 mg/g，‘美早’的总酚含量最低，为1.6 mg/g；蛋白质含量，‘先锋’最高，‘水晶’最低。

图1 7个大樱桃品种的营养成分

2.2 花色苷含量的比较

由图2 可以看出，7个大樱桃品种都含有一定量的花色苷，‘意大利红’含量最高，为9.04 mg/L，‘水晶’的花色苷含量最低。

图2 7 个大樱桃品种的花色苷含量

2.3 抗氧化能力的测定

羟自由基清除率的大小可反映大樱桃提取物的抗氧化能力。由图3可以看出，‘意大利红’‘水晶’和‘拉宾斯’3个大樱桃品种有较强的羟自由基清除抗氧化能力，羟自由基清除率均超过了20%。在清除氧自由基的过程中，‘美早’和‘红灯’2 个大樱桃品种的清除率最高，这可能和其中的类黄酮、总酚以及花色苷等成分有一定的关系。通过检测待测物质和DPPH反应后的吸光度，获得反应前后DPPH 的浓度变化，可判断待测物质的清除DPPH自由基能力。7个大樱桃品种的提取物对DPPH 自由基都有一定的清除能力，其中‘拉宾斯’的清除能力最强。7个大樱桃品种的提取物对H2O2引起的心肌细胞氧化作用都有一定的保护作用。通过对30 μg/mg 浓度的粗提物进行试验，结果显示，7个大樱桃品种的提取物与空白组和对照组进行比较，DCF 荧光值较对照组有所降低。‘意大利红’和‘美早’2个大樱桃品种的提取物抗氧化能力略高于其他品种。

图3 7 个大樱桃品种体外抗氧化能力

3 结论

本研究通过测定7个大樱桃品种的6 个营养成分，并从清除羟自由基、氧自由基、DPPH自由基和细胞ROS 角度评价了大樱桃的体外抗氧化能力。在营养成分方面，‘水晶’的总糖含量最高，‘先锋’和‘萨米托’的可滴定酸含量最高，‘先锋’的维生素C含量最高，‘意大利红’的类黄酮含量最高，‘先锋’和‘拉宾斯’的总酚含量高于其他品种，‘先锋’的蛋白质含量最高，‘意大利红’的花色苷含量最高。

此外，通过体外心肌细胞试验，发现7个大樱桃品种都有一定的抗氧化能力，‘意大利红’清除能力最强。缺血性心脏病的发生和发展与氧化应激所致的细胞损伤密切相关，缺血心肌再灌注后机体产生大量氧自由基，导致机体氧化与抗氧化能力失衡，而线粒体作为ROS的主要产生场所，也是ROS最常攻击的部位，过量的ROS会引起线粒体功能损伤[9-11]。大樱桃中含有大量的花色苷类化合物，花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物[12-16]，花色苷对羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基等均有很好的清除作用，可防止大分子物质的氧化损伤[17-19]。综上，大樱桃是一种营养丰富的功能性食品原料，对细胞氧化损伤产生的ROS也具有较强的清除能力，因而本研究的结果可为大樱桃后期的食品加工利用提供一定参考。