多指标正交试验法优选清气解毒合剂浓煎剂提取工艺*

钱海燕，曹 杨

（南京中医药大学第二附属医院·江苏省第二中医院，江苏 南京210017）

清气解毒合剂为江苏省第二中医院国家中医药管理局重点专科肺病专科学科带头人王灿晖教授结合温病理论指导自拟的临床经验方，由醋柴胡、蒲公英、金银花、蝉蜕、连翘、板蓝根、忍冬藤、鸭趾草、半枝莲组方。方中，醋柴胡、蝉蜕透邪泄热、达邪外泄，半枝莲、蒲公英、金银花、连翘、板蓝根、忍冬藤清热解毒，各种药材配伍，清中有透而不滞，虽不以发汗为目的，但服药后有汗出而解的效果。清气解毒合剂具有透邪泄热、清气解毒功效，临床主要用于治疗病毒感染所致高热不退，对风热流感所产生的内毒素具有解毒清热功效，且起效时间快，可迅速缓解临床症状。方中主药柴胡味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，疏肝解郁，和解表里，升阳举陷，退热截疟，主治感冒发热、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛、寒热往来。其指标性成分为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，具有抗炎[1]、中枢神经抑制[2]、镇痛[3]、镇咳[4]、抗菌、抗病毒作用[5]，以及对幽门结扎型、应激型、醋酸型、组织胺型溃疡也有较好防治效果[6]。刘得华[7]的动物实验从细胞水平反映了清气解毒合剂对流感病毒内毒素拮抗的影响，表明其解热效果良好。黄宝驹等[8]证实清气解毒合剂与奥司他韦胶囊治疗风热感冒（流感病毒性感冒）效果类似，都具有解毒清热功效，且起效更快，临床症状缓解更迅速。本研究中优化了我院院内制剂清气解毒合剂浓煎剂的制备工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

双波长扫描高液相色谱系统(日本岛津公司)，包括全自动在线脱气系统，SIL－20A型全自动进样系统，SPD－20A型紫外检测器，CTD－20AC型自动温控柱温箱；KH－500E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为800 W，频率为40 kHz）；DK－98－ⅡA电热恒温水浴锅，98－1－C型数字控温电热套，均购于天津市泰斯特仪器有限公司；ML104／02型电子分析天平（精度为万分之一），XSR105型电子分析天平（精度为十万分之一），PL602－L型台秤，均购于瑞士Mettler Toledo公司；调温电热器（南通市通州申通电热器厂）；R－1010型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；FLBP－250型万能高速粉碎机（上海菲力博食品机械有限公司）；YJX40－g型微压循环中药煎药机（北京东华原医疗设备有限责任公司，功率为3 000 W）；R20型蒸汽夹层锅(山东博兴县国龙厨房设备厂)。

1.2 试药

柴胡皂苷a对照品（批号为110777－201309，纯度为91.1%）；连翘苷对照品（批号为110821－200508，纯度为98.0%）；连翘酯苷A对照品（批号为111810－201707，纯度为97.3%），均购于中国食品药品检定研究院；半枝莲（批号为1905137），醋北柴胡（批号为1901010），蒲公英（批号为1922053），金银花（批号为1903133），蝉 蜕（批 号 为1901071），连 翘（批 号 为2001006），板蓝根（批号为2002018），忍冬藤（批号为1912015），鸭跖草（批号为1903273），均购于州市中药饮片厂，由本院杨燕主管中药师鉴定为正品；水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 煎煮液制备

称取半枝莲20 g，醋北柴胡10 g，蒲公英15 g，金银花10 g，蝉蜕10 g，连翘20 g，板蓝根20 g，忍冬藤30 g，鸭跖草30 g，倒入中药煎药机中浸泡、煎煮，大火烧开，保持微沸，开始计时，结束后过滤，滤渣加入中药煎药机再按上述方法提取1次，合并提取药液，再将药渣充分压榨，压榨出的药汁并入上述药液，置中转容器放置沉淀后经200目过滤筛滤过，将上述药汁置蒸汽夹层锅中加热至沸，改用文火，不断搅拌，浓缩至80～120 mL，于4℃存放备用。

2.2 含量测定

2.2.1 柴胡皂苷a

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为YMCPack ODS－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)－水(B)溶液，梯度洗脱(程序见表1)；流速为1.0 mL／min；检测波长为210 nm；进样量为20 μL；柱温为25℃。理论板数按柴胡皂苷a峰计应不低于10 000。在此色谱条件下，供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处有相同色谱峰出现，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 柴胡皂苷a高效液相色谱图A.Reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solutionFig.1 HPLC chromatograms of saikosaponin a

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase（%）

溶液制备：取柴胡皂苷a对照品适量，精密称定，加甲醇适量使溶解，即得质量浓度为0.4 mg／mL的对照品溶液。精密量取清气解毒方水煎液5 mL，置25 mL具塞锥形瓶中，精密加入含5%浓氨试液的甲醇溶液20 mL，30℃水温超声处理（功率为200 W，频率为40 kHz）30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及药渣，合并洗液与滤液，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇3 mL溶解，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得柴胡皂苷a供试品溶液[9－10]。取除柴胡、连翘外的其余药材，按1／2处方量称取，加12倍量水回流1.5 h，提取2次，过滤，按柴胡皂苷a供试品溶液制备方法制备阴性对照药材溶液。

2.2.2 连翘苷

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为YMCPack ODS－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈－水（25∶75，V／V）溶液；流速为1.0 mL／min；检测波长为277 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。理论板数按连翘苷峰计应不低于3 000。在此色谱条件下，供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处有相同色谱峰出现，且阴性对照无干扰。色谱图见图2。

图2 连翘苷高效液相色谱图A.Reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solutionFig.2 HPLC chromatograms of forsythin

溶液制备：取连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇适量使其溶解，即得质量浓度为0.2 mg／mL的对照品溶液。精密量取清气解毒方水煎液5mL，置25mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，混匀，密塞，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）25 min，放冷，再次称定质量，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，续取滤液（稀释3倍），用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得连翘苷供试品溶液。取除柴胡、连翘之外的其余药材，按1／2处方量称取，加12倍量水回流1.5 h，提取2次，过滤，按连翘苷供试品溶液方法制备，即得阴性对照药材溶液。

2.2.3 连翘酯苷A

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为YMCPack ODS－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈－0.4%冰醋酸溶液（15∶85，V／V）；流速为1.0mL／min；检测波长为330 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。理论板数按连翘酯苷A峰计应不低于5 000。在此色谱条件下，供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处有相同色谱峰出现，且阴性对照无干扰。色谱图见图3。

图3 连翘酯苷A高效液相色谱图A.Reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solutionFig.3 HPLC chromatograms of forsythiaside A

溶液制备：取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加50%甲醇适量使溶解，即得质量浓度为0.2mg／mL的对照品溶液。精密量取清气解毒方水煎液5mL，置25mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，混匀，密塞，称定质量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）25 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液（稀释3倍），用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得连翘酯苷A供试品溶液。取除柴胡、连翘外的其余药材，按1／2处方量称取，加12倍量水回流1.5 h，提取2次，过滤，按连翘酯苷A供试品溶液制备方法制备阴性对照药材溶液。

2.3 正交试验

根据前期预试验的单因素考察结果，以清气解毒合剂浓煎剂浸出物含量和柴胡皂苷a、连翘苷、连翘酯苷A 3种活性成分为指标，其中3种活性成分权重系数分别为20，浸出物含量权重系数为40，计算综合评分。综合评分＝浸出物含量／浸出物含量Max×40＋连翘苷含量／连翘苷含量Max×20＋柴胡皂苷a含量／柴胡皂苷a含量Max×20＋连翘酯苷A含量／连翘酯苷A含量Max×20。通过L9（34）正交试验对清气解毒合剂浓煎剂提取工艺进行优选，因素和水平见表2。试验结果使用SPSS17.0统计学软件进行分析，结果见表3和表4。由表4可知，各因素影响作用顺序为煎煮次数（C）＞煎煮时间（B）＞加水量（A）。方差分析结果表明，煎煮次数对有效成分的含量和浸出物得率有影响。综合有效成分含量、浸出物得率的方差分析结果，经直观分析，最终确定最优工艺条件为A2B2C3，即加12倍量水，煎煮3次，每次2 h。

表2 L9（34）正交试验因素水平表Tab.2 Factor levels of the L9（34）orthogonal test

表4 正交试验方差分析结果Tab.4 Results of the ANOVA of the orthogonal test

2.4 干膏得率测定

取表3中1－9号提取液，过滤，滤液浓缩为浸膏，取10 mL置已恒重的蒸发皿中（质量为M1），水浴蒸干溶剂，于105℃烘箱中干燥3 h后取出，移至干燥器中，冷却至室温，称定质量，在相同条件下继续干燥1 h，冷却，称定质量，直至连续2次的质量差不超过5 mg为止，记录此时的质量（M2），计算干膏得率。

表3 L9（34）正交试验结果Tab.3 Results of the L9（34）orthogonal test

得率（%）＝[（M2－M1）×（总浓缩液量／10mL）／原药材质量]×100%

2.5 最佳提取工艺验证试验

根据试验结果优选出来的最优工艺参数，按原来清气解毒合剂浓煎剂制备处方量的5倍，平行称取3份，按A2B2C3最优清气解毒合剂制备工艺进行验证试验，具体制备方法同前面，结果见表5。验证结果表明，正交试验设计的最佳提取工艺适合清气解毒合剂浓煎剂制备生产实践，方法具有可操作性。

表5 清气解毒合剂浓煎剂优选工艺验证试验结果Tab.5 Validation of optimal extraction process of concentrated decoction of Qingqi Jiedu Mixture

3 讨论

选择干膏得率及柴胡皂苷a、连翘苷、连翘酯苷A含量为清气解毒合剂浓煎剂的评价指标[11]，柴胡皂苷a为清气解毒合剂方中君药柴胡[12－14]的特征指标为产品的控制指标，同时选取臣药连翘中的连翘苷和连翘酯苷A为工艺优化指标，可间接标志连翘药材的优劣[15－16]。

清气解毒合剂浓煎剂为我院院内制剂的临床经验方。原设计了四因素的正交试验，即加水量、煎煮时间、煎煮次数和浸泡时间。预试验中，发现加水量越多、煎煮时间越长、煎煮次数越多、浸泡时间越长，提出物越多。但煎煮时间过长，某些活性物质可能会因为长时间高温煎煮而变性失活；煎煮次数和加水量越多，后期提取出的物质可能就越少，会造成不必要的浪费。考虑到工厂大生产的特点，以及实际生产所用时间和资源成本，故选择煎煮时间、煎煮次数和浸泡时间3个因素进行考察。由于长时间的提取，某些药物中的有效成分是否会造成破坏而影响药物疗效、是否要进行更多的临床试验来确定所做的提取工艺对药效有影响等，还需更多试验研究来验证。

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