川贝母药理作用机制的网络药理学研究*

周金龙，李蘩漪，金 晶△

（1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐830011；2.新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐830054）

川贝母为百合科贝母属多种植物的干燥鳞茎，有清 热润肺、化痰止咳功效[1]。近年来，随着高通量组学、计算机技术、药理学及网络数据库检索技术的日益完善，现代医学对疾病认识的不断加强，应用网络药理学技术从系统生物学角度阐述复方制剂的作用原理的临床及基础研究逐渐增多[2－4]。本研究旨在通过网络药理学筛选出川贝母的活性成分与作用靶点，通过核心靶点进行富集分析，探讨其药理学作用机制，为其临床应用提供理论基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点筛选

采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：／／tcmspw.com／index.php）收集川贝母的有效化学成分，根据Lipinski规则（LR）、口服生物利用度（OB）及药物相似性（DL）鉴定潜在的生物活性成分，以OB≥30%、DL≥0.18为标准[5]筛选出候选成分及其可能有效的化学成分。

1.2 活性成分－靶点网络构建

将得到的川贝母活性成分导入UniProt数据库（http：／／uniprot.org／）进行靶点－基因名转换，将转换后的靶点通过零代码功能富集分析（DAVID）数据库（http：／／david.abcc.ncifcrf.gov／）及BATMAN－TCM数据库（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／），进行KEGG信号通路与GO生物学富集分析，以P＜0.05为条件进行靶基因筛选，分析川贝母发挥药理作用的主要信号通路及生物过程。

1.3 靶基因相互作用网络构建

将筛选得到的靶基因在蛋白相互作用（string）数据库（https：／／string－db.org／）构建靶点蛋白相互作用网络（PPI）模型，以明确川贝母靶基因之间的相互作用，将蛋白种类设为“Homo sapiens”进行操作，最低相互作用阈值设为“medium confidence”，其他参数保持默认设置。将PPI模 型 导 入Cytoscape 3.5.1软 件，运 用“Network Analysis”功能进行分析。依据度值(degree)、介数确定川贝母关键靶基因。详见表1。

表1 网络药理学的数据来源Tab.1 Sources of the data of network pharmacology

2 结果

2.1 川贝母活性成分分析

根据TCMSP数据库检索结果，以OB≥30%及DL≥0.18为条件进行筛选，去除重复的化合物，得到可能有效的活性成分13种。详见表2。

表2 川贝母的活性成分Tab.2 The active ingredients of Fritillaria cirrhosa

2.2 川贝母作用靶点筛选

以“human”为检索条件，将PubChem CID提交到BATMAN－TCM数据库，获得63个靶基因，并根据匹配度由高到低进行排序，删除重复项后得到40个匹配度＞0.5的靶基因。详见图1及表3。

表3 川贝母主要活性成分对应靶基因Tab.3 Target genes corresponding to main active ingredients of Fritillaria cirrhosa

图1 川贝母活性成分Fig.1 The active ingredients of Fritillaria cirrhosa

2.3 生物信息学分析

将筛选得到的62个靶基因输入DAVID 6.8数据库进行GO及KEGG富集分析。

GO富集分析：共获得165个生物过程（BP）、35个细 胞 组 分（CC）、51个 分 子 功 能（MF）。其 中，60种BP、26种CC、42种MF显著富集（P＜0.05），前20位详见图2至图4。

图2 川贝母靶基因GO分析BP散点图（前20位）Fig.2 BP scatter diagram of GO analysis of target gene of Fritillaria cirrhosa（top 20）

图4 川贝母靶基因GO分析MF散点图（前20位）Fig.4 MF scatter diagram of target gene GO analysis of Fritillaria cirrhosa（top 20）

KEGG通路富集分析：在设定预测候选目标得分（≥20分）的情况下，将检索得到的靶基因作为候选靶点，共得到65条信号通路，53条通路显著富集（P＜0.05），前20位详见图5。

图5 川贝母靶基因KEGG分析CC散点图（前20位）Fig.5 CC scatter diagram of target gene KEGG analysis of Fritillaria cirrhosa（top 20）

2.4 疾病富集分析

疾病种类分类：DAVID 6.8数据库将筛选得到的靶基因富集分析后获得344种可能具有治疗作用的疾病，其中303种疾病有统计学意义（P＜0.05），包括3种肺部相关疾病（慢性阻塞性肺疾病、肺癌及哮喘)，1种炎性疾病（感染／发炎）。前20位详见表4。

表4 川贝母可能治疗的疾病种类（前20位）Tab.4 Possible diseases treated by Fritillaria cirrhosa（Top 20）

OMIM／TTD分析：BATMAN－TCM数据库将筛选得到的靶基因进行OMIM分析（http：／／www.omim.org）／TTD分析，OMIM分析获得110种疾病，其中92种疾病显著富集（P＜0.05），前20种详见表5；TTD分析获得119种疾病，其中4种疾病显著富集（P＜0.05），见表6。

表5 川贝母靶点治疗疾病OMIM分析（前20位）Tab.5 OMIM analysis of target diseases of Fritillaria cirrhosa（Top 20）

表6 川贝母靶点治疗疾病TTD分析Tab.6 TTD analysis of target diseases of Fritillaria cirrhosa

潜在活性成分靶标途径／疾病关联分析：根据已知和预测的候选目标蛋白绘制PPI图，其得分不小于每个查询TCM成分的20分，在“简化网络视图”中，仅显示显著富集KEGG途径和OMIM／TTD疾病表型。川贝母靶点PPI网络图含有333个节点、1 439条边，其中节点表示靶点，边表示靶点与靶点之间的相互作用关系。将得到的PPI数据从BATMAN数据库导出，详见图6。

图3 川贝母靶基因GO分析CC散点图（前20位）Fig.3 CC scatter diagram of target gene GO analysis of Fritillaria cirrhosa（top 20）

图6 川贝母靶点PPI图Fig.6 PPI network diagram of Fritillaria cirrhosa targets

2.5 靶点PPI分析

利用Cytoscape3.5.1软件绘制PPI图，通过Cytohubba插件鉴定川贝母的关键蛋白，其中绿色表示川贝母有效化合物；核心化合物成分为β－谷甾醇，蓝色表示作用靶基因，共40个靶基因，筛选出度值＞10的核心基因11个，其中转录因子AP－1(JUN)、半胱天冬酶3(CASP3)及热休克蛋白90基因(HSP90AA1)这3个基因度值最高，详见表7及图7；完成前15位主要靶基因形成PPI图，详见图8；完成前15位主要靶基因与化合物形成相互作用图，详见图9；最后，利用40个靶基因完成PPT图，详见图10（每个节点代表1个蛋白质，蛋白质中的螺旋代表该蛋白的结构）。

图7 川贝母化合物网络相互作用图Fig.7 Interaction network diagram of the compounds of Fritillaria cirrhosa

图8 前15位主要靶基因相互作用Cyto－degree图Fig.8 Cyto－degree diagram of the top 15 main target genes interactions

图9 前15位主要靶基因与化合物相邻及扩展图Fig.9 Cyto－degree neighbors and expanded diagram of the top 15 main target genes and compounds

图10 40个靶基因网络相互作用图Fig.10 Interaction network of 40 target genes

表7 川贝母作用的核心基因Tab.7 Core genes of Fritillaria cirrhosa

3 讨论

单味中药的组分成分复杂，在以“辨证”为原则的治疗理念下其化学成分起效机制一直不能被客观证实。网络药理学在多个公共网络平台数据库的基础上客观反映了生物大分子与化学成分间复杂的相互作用关系，融合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，将生物学网络与药物作用网络相结合，提供了探究药物与疾病相互作用机制的文献基础，与复杂疾病的治疗理念相吻合，被广泛用于中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述，按“疾病表型－生物分子网络”的思路，能充分、准确、形象地展现中药多成分作用于多靶点、多通路的过程，揭示中药作用于疾病的机制[6]。近年来，较多学者均以单味药或复方通过网络药理学研究其治疗疾病的机制，探讨其治疗有效性[7－8]。本研究中通过网络药理学筛选出川贝母的有效化学成分，为更有针对性的单体研发提供理论基础。

本研究中，共筛选出川贝母的13种化学成分，通过UniProt数据库进行靶点转换后，共获得40个有效靶基因。将筛选的川贝母有效基因靶点利用DAVID数据库中Functional Annotation分析工具对川贝母的作用靶点进行富集分析及通路分析，结果川贝母可能通过影响60种BP、26种CC、42种MF对刺激神经组织的配体－受体相互作用信号通路、钙离子信号通路、吗啡成瘾、癌症相关通路、胆碱能突触等53个通路有作用，其中与交感神经递质和受体相关通路5条，即钙离子信号通路、吗啡成瘾通路、尼古丁成瘾、逆行内源性大麻素信号传导、心肌细胞中的肾上腺素信号传导；与神经代谢相关通路4条，即刺激神经组织的配体－受体相互作用信号通路、胆碱能突触、5－羟色胺能突触、γ－氨基丁酸（GABA）能突触；与激素相关通路3条，即环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、雌激素信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟；与肿瘤相关通路3条，即癌症相关通路、肠癌通路、前列腺癌通路；与肝脏疾病相关通路2条，即乙型肝炎及非酒精性脂肪肝病；其他类通路3条，即细胞凋亡、唾液分泌及脂肪细胞中脂解的调控。

神经活性配体受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合[9]。潘玲珍等[10]研究发现，长期使用地西泮能使神经活性配体受体相互作用信号通路中16个基因表达发生显著变化，可能与长期使用地西泮导致机体所产生的药品不良反应密切相关。Ca2＋是调节细胞内多种生物调节过程中的第二信使（如收缩、分泌、突触传递、核孔调节及转录等）。Ca2＋是参与神经递质的关键化学物质，神经系统内细胞间信号释放的关键化学物质。其参与神经元的活性和免疫系统，该通路的基因具有调节海马区脑功能，能应对压力事件，与焦虑和抑郁及抗抑郁药的药效相关[11]。WANG等[12]通过对TCGA数据库的12种肿瘤的DNA甲基化状态及其相应的基因表达模式进行整合分析后发现，多种肿瘤类型的钙信号通路均发生显著高甲基化，且发生DNA高甲基化的基因恰好位于钙信号通路的关键节点，如控制胞内钙流量的G蛋白耦联受体、蛋白激酶A等，认为钙信号通路基因的异常DNA甲基化可能作为肿瘤治疗和抗肿瘤药物开发的一个潜在靶点。ADNAN等[13]研究发现，胸腺嘧啶醌与美沙酮的协同作用，涉及吗啡成瘾途径，胸腺嘧啶醌通过吗啡成瘾通路上调磷酸二酯酶1a（PDE1A）基因、γ－氨基丁酸A型受体Theta亚基和G蛋白亚基Beta3基因的表达，认为炎性反射的传出通路是胆碱能突触通路，能改善晚期哮喘炎性反应。乙酰胆碱酯酶抑制剂介导外周和中枢抗炎反应，能抑制胆碱能抗炎通路活性，减少肿瘤坏死因子－α、白细胞介素1β和白细胞介素6的水平，可能具有改善认知的作用[14]。

进一步通过DAVID数据库疾病富集分析发现，川贝母可治疗303种疾病，包括精神类疾病，酒精依赖、自闭症、精神分裂症、注意缺陷障碍品行障碍对立违抗障碍、双相情感障碍、贪食症及抑郁症；代谢性疾病，2型糖尿病、高胆固醇血症、肥胖；肿瘤性疾病，非霍奇金淋巴瘤、食管腺癌及肺癌，感染性疾病：慢性阻塞性肺疾病、哮喘及感染；其他类疾病，多发性硬化及偏头痛。通过BATMAN－TCM数据库进行疾病富集分析发现，川贝母治疗疾病多集中于代谢类疾病中，能缓解疼痛类疾病。川贝母主要用于临床治疗肺系疾病，很少用于精神类疾病，本研究汇总中扩大了川贝母的疾病治疗范围。从中医角度来看，神志类疾病与痰饮有关（痰蒙心窍、痰气交阻），川贝母味辛、性平，不仅能温化肺间之痰湿，同样能如《本草会编》所载：“治虚劳咳嗽，吐血咯血，肺痿肺痈，妇人乳痈、痈疽及诸郁之症。”

使用String数据库构建的PPI不仅可显示蛋白质分子间直接的物理相互作用，还可显示蛋白质间的间接功能相关性。通过Cytoscape 3.5.1软件制作PPI图发现川贝母的核心化学成分，网络拓扑学理论认为，网络中与节点直接连接的节点数目越多，其网络的影响力就越大，度是网络中与某个节点直接相邻节点的数目，因此Degree值因其衡量节点重要性简单、直观的特点，成为度量节点局部中心性的重要参数。根据Degree值筛选出中心节点，即网络中连接度较高的点，在网络中起到枢纽作用，具有关键的生物学功能。其中，HSP90基因（含HSP90AA1，HSP90AB1，JUN及CASP3）度值最高。

β－谷甾醇是植物甾醇类成分之一，属四环三萜类化合物，有降胆固醇、止咳、祛痰及抑制肿瘤和修复组织的作用。VALERIO等[15]发现，β－谷甾醇通过增加J774A.1鼠巨噬细胞中酪氨酸磷酸酶的活性来抑制核因子(NF)－κB和STAT1等促炎信号转导通路活性。REYES等[16]发现，β－谷甾醇能减弱RAW264.7细胞的内化、细胞内存活，并且抑制MAPKs连接的细胞内信号转导。通过诱导促炎细胞因子的产生来增强小鼠的感染抵抗力。而其他成分如钠通道蛋白[17]亦能通过影响细胞内的迁移过程、在细胞膜上的有效表达、通道降解过程及通道门控动力学等过程影响Nav 1.5通道的功能。

因此，川贝母的活性成分为酞酸双（2－乙基己基）酯及β－谷甾醇，主要治疗靶点有HSP90AA1、JUN及CASP3等，可能通过影响细胞外配体门控离子通道活性、药物结合等分子功能，突触后膜、质膜及细胞连接等细胞组分，药物反应、胆碱能突触传递及腺苷酸环化酶抑制G蛋白耦联乙酰胆碱受体信号通路等生物学过程，对刺激神经组织的配体－受体相互作用及（或）钙信号通路等而起到治疗作用。川贝母不仅能治疗数种精神类疾病，还能治疗多种代谢性疾病，通过复杂化学成分与多个靶标，可进一步阐释中药活性成分预防或治疗疾病的作用。