Relaxin协同BMP9诱导间充质干细胞成骨分化

赵辰 廖军义 肖鹏程 黄伟

摘要：目的：探讨BMP9与Relaxin在诱导间充质干细胞成骨分化过程中的协同作用。方法：以小鼠脂肪来源永生化间充质干细胞iMads作为诱导细胞，用采用腺病毒方式实现Relaxin与BMP9共表达，采用碱性磷酸酶，钙盐沉积实验及PCR等方式观察Relaxin对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。结果：Relaxin增强BMP9诱导的碱性磷酸酶Alkaline phosphatase（ALP）活性的增加，获取更多钙盐沉积。Realtime PCR提示成骨相关因子Runx2及Osx表达明显增加，同时PPAR-γ表达也明显下降，但并没有促进骨桥蛋白的表达。结论：Relaxin可协同BMP9介导的间充质干细胞成骨分化。

关键词：Relaxin ;BMP9;成骨诱导;

Objective： To investigate the synergistic effects of bone morphogenetic protein 9 （BMP9） and Relaxin on inducing osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.Methods： Immunized mouse adipocyte derived mesenchymal stem cells （IMADs） were used as seed cells. Adenovirus was used to co-express Relaxin and BMP9. The effects of Relaxin on osteogenic differentiation of BMP9-induced mesenchymal stem cells were investigated by alkaline phosphatase assay， calcium salt deposition assay and PCR in vitro and ectopic bone formation on null mice in vivo.Results： Relaxin enhanced the BMP9-induced ALP activity and resulted in increased calcium salt deposition. Realtime PCR test indicated that the expressions of osteogenic factors Runx2 and OSX were significantly increased but not OPN. Relaxin also enhance BMP9-induced ectopic bone formation with less adipogenic differentiation .Conclusion： Relaxin may collaborate with BMP9-mediated osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells

Keywords： Relaxin; BMP9; osteogenic induction;

背景：

骨缺损是当前临床面临的重要挑战[1]。采用成骨诱导因子对干细胞进行诱导以获取具有生理活性的生物工程骨是目前研究的热点[2]。在 BMP家族（bone morphogenetic protein family）成员中，BMP9被证明具有最强的成骨诱导能力，在体内外均具有较强的成骨能力。研究表明BMP9可诱导多种来源的间充质干细胞成骨分化表达成骨因子 [3]。虽然BMP9具有较强的成骨能力，但在生物工程骨构建方面仍存在着诱导能力不足的问题。通过多分子组合获取成骨最大化具有相当的现实意义。

Relaxin （Rln）是结构相关激素胰岛素/Rln家族的成员，可通过激活 Rxfps膜受体发挥自分泌、内分泌和旁分泌作用。最近，Rln受体不仅在生殖组织中被发现，而且在骨骼组织包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞也存在表达，这提示Rln可能在骨生长发育中具有生理意义[4]。然而Relaxin在间充质干细胞分化为成骨细胞和体内骨形成的作用仍然未知。Moon等人在JMBR的研究发现BMP2所诱导的成骨作用可以被Relaxin表达增强，初步证明了Rln在間充质干细胞成骨分化中的作用[5]。

以上证据提示Relaxin可能参与BMPs诱导的间充质干细胞成骨分化。BMP9作为最强的BMPs成员，能否在Rln的协同下获取更强的成骨能力，是一个颇具吸引力的课题。本研究通过腺病毒转染方式在间充质干细胞内获取BMP9与Relaxin高表达，以探究Relaxin对BMP9诱导成骨的协同作用。

1 材料与方法

1.2 主要试剂与材料

采用小鼠骨髓间充质干细胞株（C3H10T1/2）以及人胚肾293细胞株（HEK293），重组腺病毒Ad-BMP9、Ad-Relaxin，对照重组腺病毒Ad-GFP均由美国芝加哥大学分子肿瘤研究室主任何通川教授惠赠。胎牛血清（FBS）购自Bionid公司，而DMEM培养基和胰蛋白酶均购自HyClone公司，青链霉素等均购自上海碧云天生物技术有限公司。Real-time PCR引物皆由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 iMADs细胞的培养及诱导分化

iMADs细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的完全培养基在75 cm2细胞培养瓶中进行培养，分别加入适量Ad-GFP、Ad-BMP9、Ad-Relaxin、Ad-BMP9+Ad-Relaxin 病毒。感染之后的24小时后在荧光显微镜下观察。

1.3.2碱性磷酸酶染色

碱性磷酸酶（ALP）测定使用改良的Great Escape SEAP化学发光法（BD Clontech）在腺病毒感染后5和7天评估早期成骨标志物ALP活性。

1.3.3钙盐沉积染色

将iMAD细胞接种于24孔板并感染腺病毒。感染细胞在抗坏血酸（50 mg/ml）和β-甘油磷酸盐（10 mM）存在下培养。感染后第7天，使用茜素红S染色法对矿化基质结节进行钙沉淀染色.

1.3.4 Real-time PCR

按1.3.2的方法在6 孔板中培养iMADs 细胞，分别于第5天提取细胞总RNA，逆转录后行Real-time PCR，检测，Runx2，OPN，PPAR-γ与Osx相对表达水平。GAPDH做内参，每次反应设3个平行复孔和无模板阳性对照（NTC），NTC未出现特异性扩增曲线。

1.4 统计学处理

计量资料以x±s表示，采用SPSS 19.0统计软件进行随机区组设计的方差分析，组间两两比较t检验。

结果：

2.1 重组病毒感染间充质干细胞后目的基因表达

感染24 h后，Ad-BMP9、Ad-Relaxin、Ad-BMP9+Ad-Relaxin及Ad-GFP感染C3H10T1/2的感染率达40%～50%，细胞生长状态良好，未出现明显凋亡征象 （图 1），荧光检查证明感染有效，BMP9与Relaxin可在目标细胞内稳定表达（图1）。

2.2 Relaxin协同BMP9诱导MSCs体外成骨分化、

当iMADs细胞与AdBMP9/Rln共转导时，第5天就显著增强了BMP9诱导的早期成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）活性， Rln共表达显著增强了BMP9诱导的体外基质矿化，而Rln并不具有单独诱导矿化的能力（图2B）。

2.3 Relaxin协同BMP9诱导MSCs成骨分化时mRNA的表达变化

重组腺病毒感染iMADs后，提取第5天样本中mRNA检测发现在BMP9组与BMP9+Rln组中，成骨因子水平均明显高于同时间点 GFP组（P<0.05）。高表达Rln促进了成骨早期Runx2和中期Osx mRNA的表达（P<0.05）。成脂分化标志因子 PPAR-γ的表达也明显受抑制（图3）。

讨论：

BMPs家庭是备受关注的一类成骨诱导因子，BMP9证明具有强大的成骨能力。然而，BMP9介导的间充质干细胞成骨的效率仍离临床要求存在较大距离，通过分子组合的方式获得更佳的骨形成是目前的研究方向。

Rln，称为妊娠激素，在妊娠期间起到了软化宫颈的作用.Rln受体不仅在生殖组织中被发现，而且在骨骼组织包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞也发现了Rln受体的存在[6]。这提示RLN也可能在骨骼系统中具有重要作用。JMBR文章报道，鼠骨髓干细胞（BMSCS）在骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞分化的作用可被BMP2显著增强。Rln对于BMP9这一最强大的BMPs成员的作用仍不清楚。

通过Rln与BMP9共表达我们發现，Rln表达可显著增强BMP9介导的成骨分化，提高了ALP活性的同时获得了更高的钙盐沉积率。而通过Realtime PCR检测我们发现，Relaxin显著的上调了BMP9介导的Osx与Runx2表达，ALP染色提示碱性磷酸酶的表达也明显加强。而相对的OPN的表达未见明显的升高，这提示Rln可能通过早期增强成骨分化达到增强成骨的作用的。但值得注意的是，RLN本身不具备成骨诱导能力。同时Rln对成骨分化的调控具有阶段性，其更可能在成骨分化早期起到促进成骨的作用。相对应的，我们发现PPAR-γ的表达在Rln表达下明显受抑制，这提示Rln可能通过抑制BMP9介导的脂肪分化达到增强成骨的作用[7]。

综上所述，本研究初步探明了Rln增强BMP9诱导成骨的作用，其作用可能通过上调Runx2与Osx等前中期成骨因子表达而抑制脂肪化标志因子的表达，提示Relaxin可能推动成骨早期分化，这提示Relaxin可能通过抑制脂肪化达到增强成骨作用。动物实验进一步验证了Rln对BMP9成骨的诱导作用。然而由于Rln依赖于多个受体进行调节，其作用机制的多样性与复杂性，不同表达水平的Rln对在成骨分化中的作用尚待研究。

参考文献：

1.Tatara AM， Mikos AG： Tissue Engineering in Orthopaedics. J Bone Joint Surg Am 2016;98：1132-1139

2. Bara JJ， Herrmann M， Evans CH， Miclau T， Ratcliffe A， Richards RG： Improving translation success of cellbased therapies in orthopaedics. J Orthop Res 2016;34：17-21

3. Lamplot JD， Qin J， Nan G， Wang J， Liu X， Yin L， Tomal J， Li R， Shui W， Zhang H， Kim SH， Zhang W， Zhang J， Kong Y， Denduluri S， Rogers MR， Pratt A， Haydon RC， Luu HH， Angeles J， Shi LL， He TC： BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis. Am J Stem Cells 2013;2：1-21

4. Samuel CS， Lekgabe ED， Mookerjee I. The effects of relaxin on extracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease. Adv Exp Med Bio. 2007;612：88–103. 37. Silvertown JD， Summerlee AJ， Klonisch T. Relaxin‐like peptides in cancer. Int J Cancer. 2003;107（4）：513–9.

5. Jung Sun Moon， SunHun Kim et al Relaxin Augments BMP2–Induced OsteoblastDifferentiation and Bone Formation. Journal of Bone and Mineral Research， Vol. 29， No. 7， July 2014， pp 1586–1596

6.Samuel CS， Lekgabe ED， Mookerjee I. The effects of relaxin onextracellular matrix remodeling in health and fibrotic disease. Adv Exp Med Bio. 2007;612：88–103.

7. Lamplot JD， Qin J， Nan G， Wang J， Liu X， Yin L， Tomal J， Li R， Shui W， Zhang H， Kim SH， Zhang W， Zhang J， KongY， Denduluri S， Rogers MR， Pratt A， Haydon RC， Luu HH， Angeles J， Shi LL， He TC： BMP9 signaling in stem cell differentiation and osteogenesis. Am J Stem Cells 2013;2：1-21

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